Tradicionalne diagnostične strategije za odkrivanje nalezljivih bolezni zahtevajo uporabo namiznih instrumentov, ki niso primerni za testiranje na kraju samem (POCT).Nastajajoča mikrofluidika je zelo miniaturizirana, avtomatizirana in integrirana tehnologija, ki je potencialna alternativa tradicionalnim metodam za hitro, poceni in natančno diagnostiko na kraju samem.Molekularne diagnostične metode se pogosto uporabljajo v mikrofluidnih napravah kot najučinkovitejše metode za odkrivanje patogenov.Ta pregled povzema nedavni napredek v mikrofluidni molekularni diagnostiki nalezljivih bolezni tako z akademskega kot industrijskega vidika.Najprej opišemo tipično obdelavo nukleinskih kislin na čipu, vključno s predhodno obdelavo vzorca, pomnoževanjem in branjem signala.Nato se primerjajo značilnosti, prednosti in slabosti štirih vrst mikrofluidnih platform.Nato bomo razpravljali o uporabi digitalnih testov za absolutno kvantifikacijo nukleinskih kislin.Tako klasične kot nedavne komercialne mikrofluidne molekularne diagnostične naprave so povzete kot dokaz trenutnega stanja na trgu.Na koncu predlagamo prihodnje smeri za mikrofluidno diagnozo nalezljivih bolezni.
Nalezljive bolezni povzročajo patogeni, vključno z bakterijami, virusi in paraziti, ki so razširjeni po vsem svetu.Za razliko od drugih bolezni se patogeni hitro okužijo in širijo med ljudmi in živalmi gostiteljicami preko inokulacije, zraka in vode [1].Preprečevanje nalezljivih bolezni je ključnega pomena kot javnozdravstveni ukrep.Tri glavne strategije za boj proti nalezljivim boleznim: (1) nadzor nad virom okužbe;(2) prekinitev prenosne poti;(3) zaščita dovzetnega prebivalstva.Med glavnimi strategijami velja za najpomembnejšo strategijo obvladovanje vira okužbe zaradi svoje priročnosti in nizkih stroškov.Hitra diagnoza, izolacija in zdravljenje okuženih posameznikov so kritični, saj zahtevajo hitre, občutljive in natančne diagnostične strategije [2].Trenutna diagnoza nalezljivih bolezni običajno združuje klinični pregled na podlagi znakov in simptomov ter laboratorijske študije, kot sta celična kultura in molekularna diagnostika, ki zahtevajo usposobljeno osebje, delovno intenzivne postopke in drago opremo za testiranje [3, 4].Preprečevanje izbruhov nalezljivih bolezni zahteva hitro, poceni in natančno lokalno diagnozo, zlasti na območjih z omejenimi viri, kjer so nalezljive bolezni pogoste in hude [5], pa tudi zdravljenje v divjini ali na bojišču, kjer so izredne razmere nepredvidljive..zdravstvena oskrba je omejena [6].V tem kontekstu je mikrofluidika tehnologija, ki združuje tehnologije mikroelektromehanskih sistemov, nanotehnologijo ali znanost o materialih za natančno manipulacijo s tekočino [7,8,9,10], kar zagotavlja nove možnosti za zaznavanje na kraju samem (POCT).) povzročiteljev okužb zunaj bolnišnic in laboratorijev.V primerjavi s tradicionalno dolgotrajno diagnostiko mikrofluidna tehnologija ponuja prihranke vzorcev in stroškov za molekularno diagnostiko med izbruhi bolezni.Globalno širjenje koronavirusne bolezni 2019 (COVID-19) povzroča hud akutni respiratorni sindrom koronavirus 2 (SARS-CoV-2), zato ponovno poudarjamo pomen mikrofluidike za pravočasno preprečevanje in obvladovanje pandemije [11, 12]. , 13].Za razliko od tradicionalne diagnostike mikrofluidna POCT uporablja majhne prenosne naprave, od namiznih analizatorjev do majhnih stranskih testnih trakov za testiranje blizu točke vzorčenja [14].Ti testi vključujejo poenostavljeno pripravo vzorca ali brez nje, hitro ojačanje signala in občutljive odčitke signala, kar ima za posledico kratko trajanje in natančne rezultate v nekaj minutah.Razpoložljivost in množična proizvodnja mikrofluidnih zdravstvenih instrumentov sta razširili njihovo stroškovno učinkovito in neposredno diagnostično uporabo zunaj bolnišnice, v bližini pacienta in celo doma.
Med obstoječimi strategijami za diagnosticiranje nalezljivih bolezni je molekularna diagnostika ena najbolj občutljivih [15, 16].Poleg tega se molekularna diagnostika pogosto uporablja kot zlati standard za neprekinjeno odkrivanje COVID-19, kar omogoča neposredno odkrivanje za virus specifičnih regij RNK ali DNK pred nastopom imunskega odziva [17, 18].V trenutnem pregledu predstavljamo najnovejši napredek v procesih molekularne diagnostike nalezljivih bolezni, ki temeljijo na mikrofluidiki, z akademskega vidika do prihodnjih industrijskih perspektiv (slika 1).Začeli bomo s tremi ključnimi koraki pri odkrivanju nukleinske kisline: predobdelava vzorca na čipu, pomnoževanje nukleinske kisline in branje signala.Nato smo primerjali različne vrste mikrofluidnih platform z njihovo strukturo in funkcijo ter pokazali edinstvene značilnosti (prednosti in slabosti).Digitalna detekcija nukleinske kisline je nadalje obravnavana in navedena kot primer tehnologije tretje generacije za absolutno kvantifikacijo molekul infektivnih patogenov.Poleg tega bo predstavljenih več tipičnih in najnovejših komercialnih naprav POCT, ki bodo prikazale trenutno stanje trga mikrofluidnih POCT za molekularno diagnostiko.Razpravljali bomo tudi o naši viziji prihodnjih aplikacij in jo razložili.
Module mikrofluidnih čipov za detekcijo nukleinske kisline lahko glede na njihove funkcije razdelimo v tri kategorije (vzorčenje, prepoznavanje in signalizacija) [19].Med temi moduli modul za vzorčenje izvaja predvsem lizo vzorca in ekstrakcijo nukleinske kisline.Senzorski modul v glavnem nadzoruje pretvorbo in pomnoževanje signalov nukleinske kisline.Signalni modul zazna signal, ki ga pretvori in obdela senzorski modul.Na podlagi procesa zaznavanja nukleinskih kislin na čipu bomo povzeli različne čipe, ki lahko realizirajo funkcijo »input and output«.
Prvi korak pri detekciji nukleinske kisline je ekstrakcija nukleinske kisline, to je izolacija ciljne nukleinske kisline iz originalnega vzorca.Ekstrakcija nukleinske kisline se izvaja za čiščenje nukleinskih kislin iz drugih molekularnih kontaminantov, zagotavljanje celovitosti primarne strukture molekul nukleinske kisline in optimizacijo rezultatov.Ekstrakcija nukleinske kisline zahteva potrebno lizo vzorca in zajem nukleinske kisline, katerih kakovost in učinkovitost močno vplivata na rezultate raziskav in diagnostike.Vsi subtilni stranski učinki med ekstrakcijo lahko omejijo nadaljnje odkrivanje.Nekatera ostanka organskih topil, kot sta etanol in izopropanol v reagentih za izolacijo nukleinskih kislin, zavirajo na primer metode verižne reakcije s polimerazo (PCR) in metode izotermnega pomnoževanja z zanko (LAMP) [20].Ekstrakcija tekočina-tekočina in ekstrakcija v trdni fazi sta najbolj priljubljeni metodi za izolacijo nukleinskih kislin [21], vendar je ekstrakcija tekočina-tekočina na čipu izjemno omejena, saj reagenti, uporabljeni pri ekstrakciji tekočina-tekočina, povzročajo korozijo večine mikrofluidnih čipov. .Tukaj izpostavljamo metode ekstrakcije trdne faze na osnovi mikromrež in primerjamo njihove prednosti in slabosti.
Silicij je substratni material, združljiv z nukleinskimi kislinami zaradi svoje biokompatibilnosti, stabilnosti in enostavnosti spreminjanja [22].Pomembno je, da ta kompozit, modificiran s silicijevim dioksidom ali drugimi materiali, izkazuje lastnosti za adsorpcijo negativno nabitih nukleinskih kislin pri nizkem pH in visoki soli, medtem ko eluira z visokim pH in nizko soljo.Na podlagi tega pojava je možno prečistiti nukleinsko kislino.
Različne oblike materialov na osnovi silicijevega dioksida so bile uporabljene za ekstrakcijo nukleinske kisline v mikrofluidiki, kot so kremenčeve kroglice, praški, filtri iz mikrovlaken in silicijeve membrane [23, 24, 25, 26].Glede na lastnosti materiala se materiali na osnovi silicija lahko uporabljajo v mikrovezjih na različne načine.Na primer, granule silicijevega dioksida, praške in komercialne nanofiltre je mogoče preprosto namestiti v pore ali mikrokanale mikrofluidnih čipov in pomagati ekstrahirati nukleinske kisline iz vzorcev [27, 28, 29].Površinsko modificirane membrane iz silicijevega dioksida se lahko uporabljajo tudi za hitro čiščenje DNK iz patogenov po nizki ceni.Na primer, Wang et al.[30] S kombiniranjem denaturirajočih pomnoževalnih reakcij z izmenjavo verige, posredovane z vezikli, s kremenčevimi membranami, prevlečenimi s hitozanovimi oligosaharidi, je bil predstavljen vsestranski prenosni sistem, ki je uspešno zaznal 102–108 enot, ki tvorijo kolonije.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., in prisotnost virusa je bila zlahka vidna.Powell et al.[31] Mikromreže na osnovi silicija so bile nato uporabljene za odkrivanje virusa hepatitisa C (HCV), virusa humane imunske pomanjkljivosti (HIV), virusa Zika in humanega papiloma virusa ter avtomatskega razmnoževanja, v katerem je bil razvit 1,3 μl zavit mikroreaktor za zajemanje virusov RNA.in izvedite in situ ojačanje.Poleg teh metod imajo pri ekstrakciji nukleinske kisline ključno vlogo tudi površinsko modificirane mikrokolone silicijevega dioksida, saj geometrija in lastnosti modifikacijskega materiala močno povečajo učinkovitost ekstrakcije.Chen et al.[32] je predlagal mikrofluidno platformo za izolacijo RNA z nizko koncentracijo na osnovi silicijevih mikrokolonov, prevlečenih z aminokislinami.Ta mikrofluidna naprava združuje niz mikrostebrov velikosti 0,25 cm2 na silicijevem substratu za doseganje večje učinkovitosti ekstrakcije z visoko zasnovo razmerja med površino in prostornino.Prednost te zasnove je, da lahko mikrofluidna naprava doseže do 95-odstotno učinkovitost ekstrakcije nukleinske kisline.Te strategije na osnovi silicija dokazujejo vrednost hitre izolacije nukleinskih kislin po nizki ceni.V kombinaciji z mikrofluidnimi čipi lahko ekstrakcijske strategije na osnovi silicija ne le povečajo učinkovitost odkrivanja nukleinskih kislin, ampak tudi olajšajo miniaturizacijo in integracijo analitičnih naprav [20].
Metode magnetne separacije uporabljajo magnetne delce za izolacijo nukleinskih kislin v prisotnosti zunanjega magnetnega polja.Običajno uporabljeni magnetni delci vključujejo Fe3O4 ali γ-Fe2O3 magnetne delce, prevlečene s silicijevim dioksidom, amino in karboksilom [33,34,35,36].Razlikovalna lastnost magnetnih delcev v primerjavi s metodami SPE na osnovi silicija je enostavnost manipulacije in nadzora z zunanjimi magneti.
Z uporabo elektrostatične interakcije med nukleinskimi kislinami in silicijevim dioksidom se v pogojih visoke soli in nizkega pH nukleinske kisline adsorbirajo na površini magnetnih delcev, prevlečenih s silicijevim dioksidom, medtem ko se lahko v pogojih nizke soli in visokega pH molekule operejo ponovno..Magnetne kroglice, prevlečene s silicijevim dioksidom, omogočajo ekstrahiranje DNK iz vzorcev velike prostornine (400 μL) z uporabo magnetno nadzorovanega gibanja [37].Kot dokaz, Rodriguez-Mateos et al.[38] so uporabili nastavljive magnete za nadzor prenosa magnetnih kroglic v različne komore.Na podlagi magnetnih delcev, prevlečenih s silicijevim dioksidom, je mogoče ekstrahirati 470 kopij/ml genomske RNA SARS-CoV-2 iz vzorcev odpadne vode za zaznavanje reverzne transkripcije LAMP (RT-LAMP), odziv pa je mogoče prebrati v 1 uri.s prostim očesom (slika 2a).
Naprave na osnovi magnetnih in poroznih materialov.Konceptualni diagram mikrofluidne naprave IFAST RT-LAMP za detekcijo RNK SARS-CoV-2 (prirejeno po [38]).b Centrifugalna mikro naprava za dSPE nukleinske kisline bukalnih brisov (prirejeno iz [39]).c Vgrajen koncentrator vzorcev z lastnim napajanjem s kartico FTA® (prirejeno iz [50]).d Filtrirni papir Fusion 5, modificiran s hitozanom (prirejeno iz [51]).SARS-CoV-2 hud akutni respiratorni sindrom, koronavirus 2, izotermno pomnoževanje posredovano z zanko povratne transkripcije RT-LAMP, tehnološki partnerji iskalcev FTA, nukleinska kislina NA
Pozitivno nabiti magnetni delci so idealni za pritrditev fosfatnega ogrodja nukleinske kisline.Pri določeni koncentraciji soli so lahko negativno nabite fosfatne skupine nukleinskih kislin pozitivno nabite na površini delcev magnetnega kompozita.Zato so za ekstrakcijo nukleinskih kislin razvili magnetne nanodelce z hrapavo površino in visoko gostoto amino skupin.Po magnetnem ločevanju in blokiranju je mogoče magnetne nanodelce in komplekse DNA neposredno uporabiti v PCR, kar odpravlja potrebo po zapletenih in dolgotrajnih postopkih čiščenja in eluiranja [35].Magnetni nanodelci, prevlečeni z negativnimi karboksilnimi skupinami, so bili uporabljeni tudi za ločevanje nukleinskih kislin, adsorbiranih na površinah v visokokoncentriranih raztopinah polietilenglikola in natrijevega klorida [36].S temi površinsko modificiranimi magnetnimi kroglicami je ekstrakcija DNK združljiva z naknadnim pomnoževanjem.Dignan et al.[39] je opisal avtomatizirano in prenosno centrifugalno mikrofluidno platformo za predhodno obdelavo nukleinske kisline, ki omogoča netehničnemu osebju, da jo uporablja na mestu.Poleg tega združljivost izolirane DNK z LAMP, metodo, ki je zelo primerna za analizo nukleinske kisline na kraju samem, dodatno dokazuje minimalne zahteve glede opreme in primernost za kolorimetrične teste (slika 2b).
Metode z magnetnimi kroglicami ponujajo možnost avtomatizirane ekstrakcije, nekatere od njih obstajajo v komercialnih avtomatiziranih ekstraktorjih nukleinske kisline [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, ZDA), QIAcube® HT;CapitalBio (Peking, Kitajska) in Biomek®;Beckman (Miami, ZDA).), Florida, ZDA)].Prednosti kombiniranja magnetnih kroglic z mikrofluidiko je mogoče uporabiti za učinkovito avtomatizirano ekstrakcijo nukleinskih kislin, kar bi lahko potencialno pospešilo razvoj molekularne diagnostike;vendar je kombinacija magnetnih kroglic z mikrofluidiko še vedno močno odvisna od zapletenih nadzornih sistemov za natančno manipulacijo magnetnih kroglic, kar pojasnjuje priljubljenost komercialnih izdelkov, ki so zajetni in dragi, kar omejuje nadaljnjo uporabo magnetnih kroglic v POCT.
Za detekcijo nukleinske kisline je bilo uporabljenih tudi več poroznih materialov, kot so modificirani nitrocelulozni filtri, kartice Finders Technology Associates (FTA), filtrirni papirji na osnovi polietersulfona in materiali, prevlečeni z glikanom [40, 41, 42, 43, 44].Porozni vlaknasti materiali, kot je vlaknasti papir, so bili najprej uporabljeni za izolacijo DNK s fizičnim prepletanjem dolgoverižnih molekul DNK z vlakni.Majhne pore vodijo do močne fizične omejitve molekul DNK, kar pozitivno vpliva na ekstrakcijo DNK.Zaradi različnih velikosti por vlaknastega papirja učinkovitost ekstrakcije ne more zadostiti potrebam pomnoževanja DNA [45, 46].Kartica FTA je komercialni filtrirni papir, ki se uporablja na področju forenzične medicine in se pogosto uporablja na drugih področjih molekularne diagnostike.Z uporabo celuloznega filtrirnega papirja, impregniranega z različnimi kemikalijami za lizo celičnih membran v vzorcu, je sproščena DNK zaščitena pred razgradnjo do 2 leti.Nedavno je bil razvit impregniran celulozni papir za molekularno odkrivanje različnih patogenov, vključno s SARS-CoV-2, lišmaniozo in malarijo [47,48,49].HIV v izolirani plazmi se neposredno lizira, virusna nukleinska kislina pa je obogatena v pretočni membrani FTA®, ki je vgrajena v koncentrator, kar omogoča učinkovito proizvodnjo nukleinske kisline [50] (slika 2c).Glavna težava pri odkrivanju nukleinske kisline z uporabo kartic FTA je, da kemikalije, kot sta gvanidin in izopropanol, zavirajo nadaljnje reakcije pomnoževanja.Za rešitev tega problema smo razvili filtrirni papir Fusion 5, modificiran s hitozanom, ki združuje prednosti fizičnega prepletanja molekul DNK in vlaknastega filtrirnega papirja ter elektrostatične adsorpcije DNK na spojinah, modificiranih s hitozanom, da doseže visoko učinkovito ekstrakcijo nukleinske kisline. ..filtrska vlakna [51] (slika 2d).Podobno Zhu et al.[52] je prikazal metodo PCR, modificirano s hitozanom, ki temelji na in situ kapilarnem mikrofluidnem sistemu za hitro izolacijo in detekcijo RNA virusa Zika.Nukleinske kisline je mogoče adsorbirati/desorbirati v mešanem mediju lizata/PCR na podlagi lastnosti stikala za vklop/izklop hitozana.vklop in izklop«, ki se odziva na pH.
Kot je navedeno zgoraj, te strategije združujejo prednosti različnih materialov v trdni fazi in povečujejo učinkovitost ekstrakcije nukleinske kisline v mikrofluidiki.V praktičnih aplikacijah je uporaba teh materialov v velikih količinah negospodarna, pravilna površinska obdelava ali površinska modifikacija običajnih materialov s temi materiali pa lahko tudi ohrani njihovo funkcijo.Zato se verjame, da lahko izvajanje teh strategij po pilotni študiji zmanjša stroške.
Testiranje nukleinske kisline na mikrofluidnih platformah pogosto uporablja majhne količine vzorcev (< 100 µl), zato zahteva pomnoževanje ciljnih nukleinskih kislin s posebnimi sondami za pretvorbo v signal, ki je primeren za detekcijo na nižji stopnji (optično, električno in magnetno) [53, 54]. Testiranje nukleinske kisline na mikrofluidnih platformah pogosto uporablja majhne količine vzorcev (< 100 µl), zato zahteva pomnoževanje ciljnih nukleinskih kislin s posebnimi sondami za pretvorbo v signal, ki je primeren za detekcijo na nižji stopnji (optično, električno in magnetno) [53, 54]. Pri testiranju nukleinske kisline na mikrožidkostnih platformah se pogosto uporabljajo majhni volumni vzorcev (< 100 mkl), zato je potrebna pomnožitev nukleinskih kislin s pomočjo posebnih sondov za pretvorbo v signal, udoben za naknadno odkrivanje (optičnega, električnega in magnetnega) [53, 54]. Pri testiranju nukleinskih kislin na mikrofluidnih platformah se pogosto uporabljajo majhni volumni vzorcev (<100 µL), zato je potrebno pomnoževanje ciljnih nukleinskih kislin s posebnimi sondami, da se pretvorijo v signal, primeren za kasnejšo detekcijo (optično, električno in magnetno). [53, 54].微流控平台上的核酸检测通常使用小样本量（< 100 µl），因此需要使用特定探针扩增目标核酸，以转换为便于下游检测（光学、电学和磁学）的信号[53, 54 ]。微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 下游 （光学 、 电学 磁学） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]。 Obnavljanje nukleinske kisline na mikrožidkostnih platformah običajno uporablja majhne količine vzorcev (<100 mcl), ki zahtevajo ojačanje ciljne nukleinske kisline s pomočjo posebnih zondov za pretvorbo v signale za naknadno odkrivanje (optičnih, električnih in magnetnih) [53, 54]]. Detekcija nukleinskih kislin na mikrofluidnih platformah običajno uporablja majhne količine vzorcev (<100 μl), kar zahteva pomnoževanje ciljnih nukleinskih kislin s posebnimi sondami, da se pretvorijo v signale za kasnejšo detekcijo (optični, električni in magnetni) [53, 54]] .Pomnoževanje nukleinske kisline v mikrofluidiki lahko tudi pospeši reakcije, optimizira meje zaznavanja, zmanjša zahteve po vzorcu in izboljša natančnost zaznavanja [55, 56].V zadnjih letih so se z uresničitvijo hitre in natančne detekcije v mikrofluidiki uporabile različne metode pomnoževanja nukleinskih kislin, vključno s PCR in nekaterimi izotermnimi reakcijami pomnoževanja.V tem razdelku bodo povzete metode za odkrivanje nukleinskih kislin, ki temeljijo na mikrofluidnih sistemih.
PCR je simulacija procesa replikacije DNK organizma, katere teorija je podrobno opisana drugje in je tukaj ne bomo obravnavali.PCR lahko pomnoži zelo majhno količino ciljne DNA/RNA z eksponentno hitrostjo, zaradi česar je PCR močno orodje za hitro odkrivanje nukleinskih kislin.V zadnjih desetletjih je bilo razvitih veliko prenosnih mikrofluidnih naprav, opremljenih s sistemi termičnega cikla PCR, ki ustrezajo potrebam diagnostike na kraju samem [57, 58].PCR na čipu lahko razdelimo na štiri vrste (konvencionalni, neprekinjeni PCR, prostorsko preklopni in konvektivni PCR) glede na različne metode nadzora temperature [59].Na primer, Gee et al.[60] so razvili metodo kvantitativnega PCR z direktno reverzno transkripcijo (RT-qPCR) na lastni mikrofluidni platformi za multipleksno detekcijo SARS-CoV-2, virusov influence A in B v vzorcih brisa grla (slika 3a).Park et al.[61] so zgradili preprost čip za analizo patogenov z integracijo tankoslojne PCR, elektrod in mikrofluidnega modula na osnovi polidimetilsiloksana, ki ga upravljamo s prstom.Vendar obe deli vsebujeta skupne pomanjkljivosti običajne PCR.PCR zahteva toplotno kroženje, kar omejuje nadaljnjo miniaturizacijo naprave in skrajša čas testiranja.
Razvoj mikrofluidne in vesoljsko spremenjene PCR na podlagi neprekinjenega toka je ključnega pomena za reševanje tega vprašanja.Z uporabo dolgega serpentinastega kanala ali kratkega ravnega kanala lahko PCR z neprekinjenim tokom zagotovi hitro pomnoževanje z aktivnim kroženjem reagentov v treh območjih predgretja s črpalko zunaj čipa.S to operacijo se uspešno izognemo prehodni fazi med različnimi reakcijskimi temperaturami in tako občutno skrajšamo čas testiranja [62] (slika 3b).V drugi študiji Junga et al.[63] je predlagal nov rotacijski genetski analizator PCR, ki združuje značilnosti fiksne in pretočne PCR za ultrahitro in večkratno PCR z reverzno transkripcijo (slika 3c).Za pomnoževanje nukleinske kisline se bo mikročip PCR vrtel skozi tri grelne bloke pri različnih temperaturah: 1. Denaturacijski blok 94 °C, 2. Žarilni blok pri 58 °C, 3. Ekspanzijski blok pri 72 °C.
Uporaba PCR v mikrofluidiki.Shematski prikaz dirRT-qPCR na mikrofluidni platformi (prirejeno po [60]).b Shematski prikaz mikromreže PCR z neprekinjenim tokom, ki temelji na serpentinastem kanalu (prirejeno po [62]).c Shematski prikaz rotacijskega genetskega analizatorja PCR, sestavljenega iz mikročipa, treh grelnih blokov in koračnega motorja (prirejeno iz [63]).d Diagram termokonvekcijske PCR s centrifugiranjem in nastavitvijo (prirejeno po [64]).DirRT-qPCR, direktna kvantitativna verižna reakcija polimeraze s povratno transkripcijo
Z uporabo kapilar in zank ali celo tankih plošč lahko konvekcijski PCR hitro pomnoži nukleinske kisline z naravno prosto toplotno konvekcijo brez potrebe po zunanji črpalki.Na primer, mikrofluidna platforma cikličnega olefinskega polimera je bila razvita na izdelani vrtljivi grelni stopnji, ki uporablja toplotno kroženje s centrifugiranjem v mikrokanalu z zanko PCR [64] (slika 3d).Reakcijsko raztopino poganja toplotna konvekcija, ki nenehno izmenjuje visoko in nizko temperaturo v mikrokanalu z obročasto strukturo.Celoten postopek ojačanja je mogoče zaključiti v 10 minutah z mejo zaznave 70,5 pg/kanal.
Kot je bilo pričakovano, je hitra PCR močno orodje za popolnoma integrirane sisteme molekularne diagnostike in multipleksne analize odziva vzorca.Hitri PCR znatno skrajša čas, potreben za odkrivanje SARS-CoV-2, kar prispeva k učinkovitemu nadzoru pandemije COVID-19.
Za PCR je potreben kompleksen termični cikeler, ki ni primeren za POCT.V zadnjem času so bile tehnike izotermnega pomnoževanja uporabljene za mikrofluidiko, vključno z, vendar ne omejeno na LAMP, pomnoževanjem z rekombinazno polimerazo (RPA) in pomnoževanjem na podlagi zaporedij nukleinskih kislin [65,66,67,68].S temi tehnikami se nukleinske kisline pomnožijo pri konstantni temperaturi, kar olajša ustvarjanje poceni, zelo občutljivih prenosnih naprav POCT za molekularno diagnostiko.
Visokozmogljivi mikrofluidični testi LAMP omogočajo večkratno odkrivanje nalezljivih bolezni [42, 69, 70, 71].V kombinaciji s centrifugalnim mikrofluidnim sistemom lahko LAMP dodatno olajša avtomatizacijo detekcije nukleinske kisline [69, 72, 73, 74, 75].Spin-and-react SlipChip je bil razvit za vizualno detekcijo več vzporednih bakterij z uporabo LAMP [76] (slika 4a).Pri uporabi optimiziranega LAMP v testu je bilo razmerje med fluorescenčnim signalom in šumom približno 5-kratno, meja detekcije pa je dosegla 7,2 kopije/μl genomske DNA. Poleg tega je bil obstoj petih pogostih prebavnih bakterijskih patogenov, vključno z Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis in Vibrio parahaemolyticus, vizualiziran na podlagi metode v < 60 minutah. Poleg tega je bil obstoj petih pogostih prebavnih bakterijskih patogenov, vključno z Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis in Vibrio parahaemolyticus, vizualiziran na podlagi metode v < 60 minutah.Poleg tega je bila s to metodo v manj kot 60 minutah vizualizirana prisotnost petih pogostih bakterijskih patogenov prebavnega trakta, vključno z Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis in Vibrio parahaemolyticus.此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 可 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 细菌病 原体 存在 存在 ， 包括 包括 蜡状 芽孢杆菌 大 肠杆菌 、 、 肠 肠 沙门 氏 、 河流 河流 弧菌 弧菌 和 副溶血性。此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 视化 视化 了 种 常见 常见 消化道 细菌病 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 芽孢杆菌 、 大 、 肠 氏 氏 菌 菌 、 弧菌 和 副溶血 性 性 。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌HIP HIPPoleg tega je bila s to metodo v manj kot 60 minutah vizualizirana prisotnost petih pogostih bakterijskih patogenov prebavil, vključno z Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius in Vibrio parahaemolyticus.
Prednosti LAMP v mikrofluidiki med drugim vključujejo hiter odziv in miniaturno zaznavanje.Vendar zaradi reakcijske temperature (okoli 70 °C) med LAMP neizogibno nastanejo aerosoli, kar povzroči visoko stopnjo lažno pozitivnih rezultatov.Za LAMP je treba optimizirati tudi specifičnost testa, zasnovo primerja in nadzor temperature.Poleg tega so zasnove čipov, ki izvajajo zaznavanje več ciljev na enem čipu, velike vrednosti in jih je treba razviti.Poleg tega je LAMP primeren za večnamensko detekcijo, integrirano v enem čipu, kar je zelo pomembno, vendar je še veliko prostora za razvoj.
Visoko lažno pozitivno stopnjo LAMP je mogoče delno zmanjšati z RPA, saj razmeroma nizka reakcijska temperatura (~37 °C) povzroči relativno malo težav z izhlapevanjem [77].V sistemu RPA dva nasprotna primerja sprožita sintezo DNK z vezavo na rekombinazo in pomnoževanje se lahko zaključi v 10 minutah [78,79,80,81].Zato je celoten postopek RPA veliko hitrejši od PCR ali LAMP.V zadnjih letih se je pokazalo, da mikrofluidna tehnologija dodatno izboljša hitrost in natančnost RPA [82,83,84].Na primer, Liu et al.[85] so razvili mikrofluidni integrirani test pomnoževanja polimeraze rekombinaze z lateralnim tokom za hitro in občutljivo odkrivanje SARS-CoV-2 z integracijo reverzne transkripcije RPA (RT-RPA) in univerzalnega sistema za zaznavanje testnih trakov s lateralnim tokom.v en sam mikrofluidni sistem.Slika 4b).Meja detekcije je 1 kopija/µl ali 30 kopij/vzorec, detekcija pa se lahko zaključi v približno 30 minutah.Kong et al.so razvili nosljivo mikrofluidno napravo.[86] so uporabili telesno temperaturo in sistem za zaznavanje fluorescence na mobilnih telefonih za hitro in neposredno odkrivanje DNA HIV-1 z uporabo RPA (slika 4c).Nosljivi test RPA zazna 100 kopij/ml ciljnega zaporedja v 24 minutah, kar dokazuje velik potencial za hitro diagnosticiranje dojenčkov, okuženih s HIV-1, v okoljih z omejenimi viri.
Izotermna amplifikacija pri testiranju na kraju samem (POCT).Razvoj in proizvodnja spin in reakcijskega SlipChip.Po plazemskem varjenju sta bila zgornji in spodnji čip sestavljena z nizom matic, da se oblikuje končni čip (prilagojeno iz [76]).b Shema sistema MI-IF-RPA za odkrivanje COVID-19 (prirejeno po [85]).c Shema nosljivega RPA testa za hitro odkrivanje DNK HIV-1 (prirejeno po [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM karboksifluorescein, virus humane imunske pomanjkljivosti HIV, RPA rekombinazno pomnoževanje s polimerazo, LED svetleča dioda, MI-IF-RPA Microfluidics Integrated Lateral Flow Recombinase-Polymerase Ojačitev
RPA na osnovi mikrofluidov se hitro razvija, vendar so stroški izdelave čipov in poraba reakcij previsoki in jih je treba zmanjšati, da bi povečali razpoložljivost te tehnologije.Poleg tega lahko visoka občutljivost RPA vpliva na ojačanje nespecifičnih produktov, zlasti v prisotnosti kontaminacije.Te omejitve lahko vplivajo na uporabo RPA v mikrofluidnih sistemih in si zaslužijo nadaljnjo optimizacijo.Za izboljšanje izvedljivosti mikrofluidnih strategij na osnovi RPA v POCT so potrebni tudi dobro zasnovani primerji in sonde za različne tarče.
Cas13 in Cas12a imata sposobnost naključnega cepljenja nukleinskih kislin in ju je zato mogoče razviti kot orodji za odkrivanje in diagnostiko.Cas13 in Cas12a se aktivirata po vezavi na tarčno DNA oziroma RNA.Ko je protein aktiviran, začne cepiti druge bližnje nukleinske kisline, nakar lahko vodilne RNA, ki ciljajo na za patogen specifične nukleinske kisline, cepijo ugasnjene fluorescentne sonde in sprostijo fluorescenco.Na podlagi te teorije so Kellner et al.[87] so razvili metodo, ki temelji na Cas13 [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], in Broughton et al.[88] so razvili drug pristop, ki temelji na Cas12a [CRISPR Trans Reporter targeting DNA endonuclease (DTECR)].
V zadnjih letih so se pojavile različne metode za odkrivanje nukleinskih kislin, ki temeljijo na CRISPR [89, 90].Običajne metode, ki temeljijo na CRISPR, so pogosto dolgotrajne in delovno intenzivne zaradi številnih postopkov, vključno z ekstrakcijo nukleinske kisline, pomnoževanjem in odkrivanjem CRISPR.Izpostavljenost tekočin zraku lahko poveča možnost lažno pozitivnih rezultatov.Glede na zgoraj navedeno sistemi, ki temeljijo na CRISPR, nujno potrebujejo optimizacijo.
Za detekcijske aplikacije CRISPR-Cas12a in CRISPR-Cas13a je bila razvita pnevmatsko krmiljena mikrofluidna platforma, ki lahko izvaja 24 vzporednih analiz [91].Sistem je opremljen z napravo za zaznavanje fluorescence, ki obide pomnoževanje nukleinske kisline in samodejno zazna femtomolarne vzorce DNK in RNK.Chen et al.[92] integrirano pomnoževanje rekombinaze s sistemom CRISPR-Cas12a v centrifugalni mikrofluidiki (slika 5a).To delo premaga težave pri integraciji teh dveh procesov, ker lahko Cas12a prebavi sporočilno DNK in zavira proces pomnoževanja.Poleg tega Chen et al.[92] je dodatno vnaprej shranil reakcijske reagente v centrifugalno mikrofluidno kontrolo, da je samodejno dokončal celoten proces.V drugem delu, Silva et al.[93] so razvili diagnostično metodo brez ojačanja CRISPR/Cas12a in pametni telefon za odkrivanje SARS-CoV-2 (slika 5b).Ta test, znan kot sistem brez pomnoževanja na osnovi mobilnega telefona, vključuje od CRISPR/Cas odvisen encim, ki temelji na vizualizaciji signalov mehurčkov, ki jih ustvari katalaza, v mikrofluidnih kanalih s pametnim telefonom.Občutljiva detekcija manj kot 50 kopij/µl nukleinske kisline brez predhodnega pomnoževanja, celoten postopek od vbrizgavanja vzorca do odčitavanja signala traja le 71 minut.
Metode detekcije nukleinskih kislin, ki temeljijo na CRISPR.Centrifugalni POCT za integrirano molekularno diagnostiko, ki temelji na CRISPR (prirejeno po [92]).b Razvoj testa CASCADE za analizo SARS-CoV-2 na pametnem telefonu (prirejeno po [93]).Pomnoževanje rekombinaze RAA, sosednji motiv protospacerja PAM, kratka palindromska ponavljanja CRISPR v rednih intervalih, sistem CASCADE brez pomnoževanja mobilnega telefona z encimi, odvisnimi od CRISPR/CAS, 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]karbodiimid hidroklorid EDC
Kot zadnji korak pri odkrivanju nukleinske kisline odkrivanje signala neposredno odraža diagnostične rezultate in je ključni dejavnik pri razvoju učinkovitega, občutljivega in natančnega POCT.Signale je mogoče brati z različnimi metodami, kot so fluorescentne, elektrokemične, kolorimetrične in magnetne strategije.V tem razdelku opisujemo utemeljitev vsakega pristopa in primerjamo molekularno diagnostiko nalezljivih bolezni v mikrofluidiki.
Strategije, ki temeljijo na fluorescenci, se pogosto uporabljajo za POCT diagnostiko nalezljivih bolezni zaradi svojih izjemnih prednosti odlične občutljivosti, nizkih stroškov, enostavnosti delovanja in analize na kraju samem [94, 95].Te strategije uporabljajo označene fluoroforje, kot so fluorescentna barvila in nanomateriali, za ustvarjanje zaznavnega signala (izboljšanje ali dušenje fluorescence).Ta ugotovitev nakazuje, da lahko strategije, ki temeljijo na fluorescenci, razdelimo na neposredno fluorescentno označevanje, fluorescenčno detekcijo ob vklopu in izklopu signala [96].Neposredno odkrivanje fluorescenčne oznake uporablja posebne fluorescenčne oznake za označevanje specifičnih ligandov, ki ustvarijo določeno količino fluorescence, ko so selektivno vezani na tarčo.Za detekcijo fluorescence na osnovi signala je kakovost fluorescenčnega signala pozitivno povezana z velikostjo, ki nas zanima.Intenzivnost fluorescence je zanemarljiva v odsotnosti tarče in jo je mogoče zaznati, ko je prisotna zadostna količina tarče.Nasprotno pa je intenzivnost fluorescence, ki jo zazna fluorescenca "izključenega signala", obratno sorazmerna s količino tarče, na začetku doseže največjo vrednost in se postopoma zmanjšuje, ko se tarča poveča.Na primer, z uporabo mehanizma trans-cepitve, odvisnega od tarče CRISPR-Cas13a, Tian et al.[97] so razvili novo strategijo prepoznavanja za odkrivanje RNA, ki neposredno obidejo reverzno transkripcijo (slika 6a).Po vezavi na komplementarne ciljne RNA se lahko aktivira kompleks CRISPR-Cas13-RNA, kar sproži transkolateralno cepitev z nespecifičnimi reporterskimi RNA.Fluorescentno označeni reporter [fluorofor (F)] duši dušilec (Q) nedotaknjen in fluorescira, ko ga odcepi aktivirani kompleks.
Prednost elektrokemične detekcije je visoka hitrost detekcije, enostavna proizvodnja, nizki stroški, enostavno prenašanje in samodejni nadzor.Je močna analitična metoda za aplikacije POCT.Na osnovi grafenskih tranzistorjev z učinkom polja Gao et al.[98] so razvili nanobiosenzor za multipleksno detekcijo antigenov borelioze iz bakterij Borrelia burgdorferi z mejo detekcije 2 pg/mL (slika 6b).
Kolorimetrični testi so bili uporabljeni v aplikacijah POCT, pri čemer imajo koristi od prednosti prenosljivosti, nizkih stroškov, enostavne priprave in vizualnega branja.Kolorimetrična detekcija lahko uporablja oksidacijo peroksidaze ali peroksidazi podobnih nanomaterialov, agregacijo nanomaterialov in dodajanje indikatorskih barvil za pretvorbo informacij o prisotnosti ciljnih nukleinskih kislin v vidne barvne spremembe [99, 100, 101].Zlasti nanodelci zlata se pogosto uporabljajo pri razvoju kolorimetričnih strategij in zaradi njihove sposobnosti, da povzročijo hitre in znatne barvne spremembe, narašča zanimanje za razvoj kolorimetričnih platform POCT za in situ diagnozo nalezljivih bolezni [102].Z integrirano centrifugalno mikrofluidno napravo [103] je mogoče patogene, ki se prenašajo s hrano, v kontaminiranih vzorcih mleka samodejno zaznati na ravni 10 bakterijskih celic, rezultate pa je mogoče vizualno prebrati v 65 minutah (slika 6c).
Tehnike magnetnega zaznavanja lahko natančno zaznajo analite z uporabo magnetnih materialov, v zadnjih desetletjih pa je bilo veliko zanimanja za aplikacije POCT.Tehnike magnetnega zaznavanja imajo nekaj edinstvenih prednosti, kot so poceni magnetni materiali namesto dragih optičnih komponent.Vendar pa uporaba magnetnega polja izboljša učinkovitost detekcije in skrajša čas priprave vzorca [104].Poleg tega rezultati magnetnega sondiranja kažejo visoko specifičnost, občutljivost in visoko razmerje med signalom in šumom zaradi nepomembnega signala magnetnega ozadja bioloških vzorcev [105].Sharma et al.integriral biosenzor na osnovi magnetnega tunelskega spoja v prenosno platformo mikročipa.[106] za multipleksno detekcijo patogenov (slika 6d).Biosenzorji občutljivo zaznajo subnanomolarne nukleinske kisline, izolirane iz patogenov.
Tipična metoda zaznavanja signala.Koncept hiperlokalizirane detekcije Cas13a (prirejeno iz [97]).b Grafenski nanobiosenzor FET v kombinaciji z Lyme GroES scFv (prirejeno iz [98]).c Kolorimetrične indikacije za multipleksno odkrivanje patogenov, ki se prenašajo s hrano, v centrifugalnem mikrofluidnem čipu: vzorci št. 1 in št. 3 s ciljnimi patogeni ter vzorci št. 2, št. 4 in št. 5 brez ciljnih patogenov (prilagojeno iz [103]) .d Biosenzor, ki temelji na magnetnem tunelskem spoju, vključno s platformo, vgrajenim blokirnim ojačevalnikom, krmilno enoto in napajalnikom za generiranje/pridobivanje signala (prirejeno po [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS dimetikon, PMMA polimetil metakrilat
Kljub odličnim lastnostim zgornjih metod odkrivanja imajo še vedno pomanjkljivosti.Te metode so primerjane (tabela 1), vključno z nekaterimi aplikacijami s podrobnostmi (prednosti in slabosti).
Z razvojem mikrofluidike, mikroelektromehanskih sistemov, nanotehnologije in znanosti o materialih uporaba mikrofluidnih čipov za detekcijo nalezljivih bolezni nenehno napreduje [55,96,107,108].Natančna manipulacija z miniaturno opremo in tekočinami prispeva k diagnostični točnosti in stroškovni učinkovitosti.Zato so bili za nadaljnji razvoj vloženi napori za optimizacijo in nadgradnjo čipov, kar je povzročilo različne mikrofluidne čipe z različnimi strukturami in funkcijami.Tukaj na kratko predstavljamo več običajnih tipov mikrofluidnih platform in primerjamo njihove značilnosti (prednosti in slabosti).Poleg tega se večina spodaj navedenih primerov osredotoča predvsem na boj proti SARS-CoV-2.
LOCC so najpogostejši miniaturizirani kompleksni analitični sistemi in njihove operacije so zelo miniaturizirane, integrirane, avtomatizirane in vzporedne od vbrizgavanja in priprave vzorca, nadzora pretoka in detekcije tekočine [109, 110].S tekočinami se upravlja s skrbno zasnovano geometrijo in medsebojnim delovanjem številnih fizičnih učinkov, kot so gradienti tlaka, kapilarno delovanje, elektrodinamika, magnetna polja in akustični valovi [111].LOCC kaže odlične prednosti pri visoko zmogljivem presejanju in večkratnem odkrivanju, s hitro analizo, majhno velikostjo vzorca, nizko porabo energije ter visoko učinkovitostjo upravljanja in delovanja;vendar so naprave LOCC zelo občutljive, proizvodnja, pakiranje in povezovanje.Vendar se multipleksiranje in ponovna uporaba soočata z ogromnimi težavami [96].V primerjavi z drugimi platformami ima LOCC edinstvene prednosti v smislu največje raznolikosti aplikacij in najboljše tehnološke združljivosti, očitne pa so tudi njegove slabosti, in sicer visoka kompleksnost in slaba ponovljivost.Odvisnost od zunanjih črpalk, ki so pogosto obsežne in drage, dodatno omejuje njihovo uporabo pri POCT.
Med izbruhom COVID-19 je bil LOCC deležen veliko pozornosti.Hkrati obstaja več novih čipov, ki združujejo več tehnologij.Na primer, pametni telefoni se zdaj pogosto uporabljajo kot prenosne analitične naprave in imajo velik potencial za integracijo LOCC.Sun et al.[21] so izdelali mikrofluidni čip, ki omogoča multipleksiranje specifičnih zaporedij nukleinskih kislin petih patogenov, vključno s SARS-CoV-2, z uporabo LAMP in jih analizirali s pametnim telefonom v 1 uri po koncu reakcije.Kot drug primer Sundah et al.[112] je ustvaril molekularno stikalo [katalitsko pomnoževanje s stikalom molekularnega prehodnega stanja (CATCH)] za neposredno in občutljivo zaznavanje tarč SARS-CoV-2 RNA z uporabo pametnih telefonov. CATCH je združljiv s prenosnim LOCC in dosega vrhunsko zmogljivost (približno 8 kopij RNA/μl; < 1 h pri sobni temperaturi) [112]. CATCH je združljiv s prenosnim LOCC in dosega vrhunsko zmogljivost (približno 8 kopij RNA/μl; < 1 h pri sobni temperaturi) [112]. CATCH je združljiv s prenosnim LOCC in zagotavlja odlično zmogljivost (primer 8 kopij RNK/mkl; < 1 h pri sobni temperaturi) [112]. CATCH je združljiv s prenosnim LOCC in zagotavlja odlično prepustnost (približno 8 kopij RNA/µl; < 1 h pri sobni temperaturi) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112].。 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112].。 CATCH je združljiv s prenosnimi LOCC in ima izjemno zmogljivost (primer 8 kopij RNK/mkl; < 1 ura pri sobni temperaturi) [112]. CATCH je združljiv s prenosnimi LOCC in ima odlično delovanje (približno 8 kopij RNA/µl; < 1 ura pri sobni temperaturi) [112].Poleg tega naprave LOCC za molekularno diagnostiko uporabljajo tudi nekatere pogonske sile, kot so vakuum, raztezanje in električna polja.Kang et al.[113] je prikazal ultrahitro PCR z nanoplazmo na čipu v realnem času za hitro in kvantitativno diagnozo COVID-19 na terenu z vakuumskim plazmonskim tekočim PCR čipom.Li et al.[114] je nato razvil mikrofluidni čip, ki ga poganja razteg, ki je omogočil diagnozo COVID-19.Platforma uporablja sistem ojačanja RT-LAMP, da ugotovi, ali je vzorec kvalitativno pozitiven ali negativen.Pozneje so Ramachandran et al.[115] so dosegli ustrezne gradiente električnega polja z izotakoforezo (ITP), tehniko selektivnega fokusiranja ionov, ki se izvaja v mikrofluidiki.Z ITP se lahko ciljna RNA iz neobdelanih vzorcev brisa nazofarinksa samodejno očisti.Nato so Ramachandran et al.[115] Kombinacija tega čiščenja ITP s testi LAMP in CRISPR, izboljšanimi z ITP, je odkrila SARS-CoV-2 v človeškem nazofaringealnem brisu in kliničnih vzorcih v približno 35 minutah.Poleg tega se nenehno pojavljajo nove ideje.Jadhav et al.[116] je predlagal diagnostično shemo, ki temelji na površinsko izboljšani Ramanovi spektroskopiji v kombinaciji z mikrofluidno napravo, ki vsebuje bodisi navpično usmerjene ogljikove nanocevke, prevlečene z zlatom/srebrom, ali mikro/nanocevke z elektrospredenjem za enkratno uporabo.Membransko funkcionalizirani vgrajeni filtrirni mikrokanali so za enkratno uporabo.Naprava adsorbira viruse iz različnih telesnih tekočin/izločkov, kot so slina, nazofarinks in solze.Tako je titer virusa obilen in virus je mogoče natančno identificirati z ramanskim podpisom.
LOAD je centrifugalna mikrofluidna platforma, v kateri so vsi procesi nadzorovani s frekvenčnim protokolom, ki vrti mikrostrukturiran substrat [110].Za napravo LOAD je značilna uporaba centrifugalne sile kot pomembne gonilne sile.Na tekočine delujejo tudi kapilarne, Eulerjeve in Coriolisove sile.Z uporabo naprave za centrifugo se analize izvajajo v neprekinjenem tekočem delovanju od radialnega položaja navznoter do položaja navzven, s čimer se odpravi potreba po dodatnih zunanjih cevkah, črpalkah, aktuatorjih in aktivnih ventilih.Skratka, en sam način krmiljenja poenostavi delovanje.Sile, ki delujejo na tekočino v istem mikrofluidnem kanalu na enaki razdalji od težišča, so enake, kar omogoča ponovitev strukture kanala.Tako je oprema LOAD preprostejša in bolj ekonomična za načrtovanje in izdelavo kot običajna oprema LOCC, medtem ko so reakcije v veliki meri neodvisne in vzporedne;vendar je zaradi visoke mehanske trdnosti centrifugalne opreme razpoložljiv material za odrezke omejen in majhne količine so težavne.do avta.Hkrati je večina naprav LOAD zasnovanih samo za enkratno uporabo, kar je drago za obsežno detekcijo [96, 117, 118, 119].
V zadnjih desetletjih je LOAD, ki velja za eno najbolj obetavnih mikrofluidnih naprav, prejel veliko pozornosti raziskovalcev in proizvajalcev.Tako je LOAD postal široko sprejet in se uporablja za molekularno diagnostiko infekcijskih patogenov [120, 121, 122, 123, 124], zlasti med izbruhom COVID-19.Na primer, konec leta 2020 so Ji et al.[60] je prikazal neposredni test RT-qPCR za hitro in avtomatizirano vzporedno odkrivanje SARS-CoV-2 ter okužb z virusoma influence A in B v vzorcih brisa grla.Nato Xiong et al.[74] je predstavil diskoidno mikrofluidno platformo, integrirano v LAMP, za hitro, natančno in hkratno odkrivanje sedmih človeških respiratornih koronavirusov, vključno s SARS-CoV-2, v 40 minutah.V začetku leta 2021 sta de Oliveira et al.[73] je prikazal centrifugalni mikrofluidni čip iz polistirenskega tonerja, ročno upravljan z vrtljivim prstom, za molekularno diagnostiko COVID-19 z RT-LAMP.Kasneje sta Dignan et al.[39] je predstavil avtomatizirano prenosno centrifugalno mikronapravo za čiščenje SARS-CoV-2 RNA neposredno iz odsekov bukalnih brisov.Medved idr.[53] je predlagal linijski sistem za vzorčenje aerosolov SARS-CoV-2 z vrtljivim mikrofluidnim fluorescenčnim čipom majhne prostornine z mejo zaznavanja 10 kopij/μl in minimalnim pragom cikla 15 minut.Suarez et al.[75] je nedavno poročal o razvoju integrirane modularne centrifugalne mikrofluidne platforme za neposredno detekcijo SARS-CoV-2 RNA v toplotno inaktiviranih vzorcih nazofaringealnih brisov z uporabo LAMP.Ti primeri prikazujejo velike prednosti in obljube LOAD v molekularni diagnostiki COVID-19.
Leta 1945 sta Muller in Clegg [125] prvič predstavila mikrofluidne kanale na papirju s filtrirnim papirjem in parafinom.Leta 2007 je skupina Whitesides [126] ustvarila prvo funkcionalno papirnato platformo za testiranje beljakovin in glukoze.Papir je postal idealen substrat za mikrofluidiko.Papir ima inherentne lastnosti, kot so hidrofilnost in porozna struktura, odlična biokompatibilnost, majhna teža, fleksibilnost, zložljivost, nizki stroški, enostavna uporaba in priročnost.Klasični µPAD so sestavljeni iz hidrofilnih/hidrofobnih struktur, zgrajenih na papirnatih substratih.Glede na tridimenzionalno strukturo lahko μPAD delimo na dvodimenzionalne (2D) in tridimenzionalne (3D) μPAD.2D µPAD-ji so proizvedeni z oblikovanjem hidrofobnih meja za oblikovanje mikrofluidnih kanalov, medtem ko so 3D µPAD-ji običajno izdelani iz nizov plasti 2D mikrofluidnega papirja, včasih z zgibanjem papirja, tehnikami zdrsa, odprtimi kanali in 3D-tiskanjem [96].Vodne ali biološke tekočine na μPAD primarno nadzoruje kapilarna sila brez zunanjega vira energije, kar olajša predhodno shranjevanje reagentov, ravnanje z vzorci in multipleksno odkrivanje.Vendar pa natančen nadzor pretoka in multipleksno zaznavanje ovirajo nezadostna hitrost zaznavanja, občutljivost in možnost ponovne uporabe [96, 127, 128, 129, 130].
Kot nenavadna mikrofluidna platforma je bil μPAD široko promoviran in razvit za molekularno diagnozo nalezljivih bolezni, kot so HCV, HIV in SARS-CoV-2 [131, 132].Za selektivno in občutljivo detekcijo HCV, Tengam et al.[133] so razvili nov biosenzor na osnovi fluorescentnega papirja z uporabo visoko specifične sonde nukleinske kisline na osnovi pirolidinil peptida.Nukleinske kisline so kovalentno imobilizirane na delno oksidiranem celuloznem papirju z reduktivno alkilacijo med amino skupinami in aldehidnimi skupinami, detekcija pa temelji na fluorescenci.Te signale lahko bere posebej izdelan pripomoček s prenosno fluorescentno kamero v kombinaciji s kamero mobilnega telefona.Kasneje sta Lu et al.[134] so zasnovali fleksibilno elektrodo na osnovi papirja, ki temelji na nanodelcih niklja/zlata/ogljikovih nanocevkah/polivinil alkoholnih organokovinskih okvirih za detekcijo tarče HIV s hibridizacijo DNA z uporabo metilen modrega kot redoks indikatorja DNA.Nedavno so Chowdury et al.[135] je predstavil hipotetično zasnovo platforme za testiranje µPAD na mestu oskrbe z uporabo surove bolnikove sline v kombinaciji z LAMP in prenosno slikovno tehnologijo za odkrivanje analita COVID-19.
Preskusi bočnega toka vodijo tekočine s kapilarnimi silami in nadzorujejo gibanje tekočine z omočljivostjo in značilnostmi poroznih ali mikrostrukturiranih substratov.Naprave za stranski pretok so sestavljene iz vzorca, konjugata, inkubatorja in detekcije ter vpojnih blazinic.Molekule nukleinske kisline v LFA prepoznajo specifična veziva, ki so vnaprej shranjena na veznem mestu in se vežejo kot kompleksi.Ko tekočina prehaja skozi inkubacijske in detekcijske plošče, komplekse ujamejo molekule za zajem, ki se nahajajo na testnih in kontrolnih linijah, kar prikazuje rezultate, ki jih je mogoče prebrati neposredno s prostim očesom.Običajno je LFA mogoče dokončati v 2–15 minutah, kar je hitreje od tradicionalnega odkrivanja.Zaradi posebnega mehanizma LFA zahteva malo operacij in ne zahteva dodatne opreme, zaradi česar je uporabniku zelo prijazen.Enostaven je za izdelavo in miniaturizacijo, stroški papirnatih substratov pa so nižji.Vendar se uporablja samo za kvalitativno analizo, kvantitativno odkrivanje pa je zelo težko, zmožnost multipleksiranja in prepustnost pa sta zelo omejeni in naenkrat je mogoče odkriti samo eno zadostno nukleinsko kislino [96,110,127].
Čeprav je večina aplikacij LFA osredotočena na imunske teste, je učinkovita in priljubljena tudi uporaba LFA za molekularno diagnostiko v mikrofluidnih čipih [136].V primeru virusa hepatitisa B, HIV in SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] je predlagal platformo LFA nanodelcev s pretvorbo navzgor in pokazal vsestranskost te miniaturizirane in prenosne platforme z občutljivim in kvantitativnim odkrivanjem več tarč, kot je nukleinska kislina HBV.Poleg tega Fu et al.[138] je prikazal novo LFA, ki temelji na površinsko izboljšani ramanski spektroskopiji za kvantitativno analizo DNA HIV-1 pri nizkih koncentracijah.Za hitro in občutljivo odkrivanje SARS-CoV-2, Liu et al.[85] so razvili mikrofluidno integrirano analizo bočnega toka RPA s kombinacijo RT-RPA in univerzalnega sistema za zaznavanje bočnega toka v en sam mikrofluidni sistem.
Uporaba različnih mikrofluidnih platform se razlikuje glede na specifične študije, pri čemer se v celoti izkoriščajo zmogljivosti in prednosti platform.S cenovno dostopnimi ventili, črpalkami in kanali je LOCC najcelovitejša platforma za raznolikost aplikacij in interoperabilnost z največjim prostorom za razvoj.Zato upamo in priporočamo, da se najnovejše študije izvedejo na LOCC kot prvi poskus in da se pogoji optimizirajo.Poleg tega se pričakuje, da bodo v sistemu odkrite in uporabljene bolj učinkovite in natančne metode.LOAD se odlikuje po natančnem nadzoru tekočin iz obstoječih naprav LOCC in dokazuje edinstvene prednosti pri posameznih pogonih s centrifugalno silo brez potrebe po zunanjih pogonih, medtem ko so vzporedni odzivi lahko ločeni in sinhronizirani.Tako bo v prihodnosti LOAD postal glavna mikrofluidna platforma z manj ročnimi operacijami ter bolj zrelimi in avtomatiziranimi tehnologijami.Platforma µPAD združuje prednosti LOCC in materialov na papirni osnovi za poceni diagnostiko za enkratno uporabo.Zato se mora prihodnji razvoj osredotočiti na priročne in dobro uveljavljene tehnologije.Poleg tega je LFA zelo primeren za zaznavanje s prostim očesom, saj obeta zmanjšanje porabe vzorcev in pospešitev zaznavanja.Podrobna primerjava platforme je prikazana v tabeli 2.
Digitalne analize razdelijo vzorec v številne mikroreaktorje, od katerih vsak vsebuje diskretno število ciljnih molekul [139, 140].Digitalni testi ponujajo znatne prednosti za izvajanje absolutne kvantifikacije z izvajanjem na tisoče vzporednih biokemičnih poskusov hkrati in posamezno v predelkih mikronskega merila namesto v neprekinjeni fazi.V primerjavi s tradicionalno mikrofluidiko lahko kompartmentne reakcije zmanjšajo volumen vzorca, povečajo učinkovitost reakcije in jih je enostavno integrirati z drugimi analitskimi metodami brez potrebe po kanalih, črpalkah, ventilih in kompaktnih oblikah [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .Naslednji dve metodi se uporabljata v digitalnih testih za doseganje enotnega in natančnega ločevanja raztopin, vključno z reagenti in vzorci, kot so celice, nukleinske kisline in drugi delci ali molekule: (1) kapljične emulzije, ki izkoriščajo nestabilnost tekočega vmesnika;(2) delitev nizov se izvaja z geometrijskimi omejitvami naprave.Pri prvi metodi lahko kapljice, ki vsebujejo reagente in vzorce v mikrokanalih, ustvarimo s pasivnimi metodami, kot so sotok, prečni tok, fokusiranje toka, stopenjsko emulgiranje, mikrokanalno emulgiranje in membrane s pomočjo viskoznih strižnih sil in emulgiranje s spremembo kanala.lokalizacijo [143, 145, 146, 148, 149] ali z uporabo aktivnih metod [150, 151], ki vnašajo dodatno energijo z električnim, magnetnim, toplotnim in mehanskim nadzorom.Pri slednjem pristopu je najboljša enotnost volumna tekočine v mikrofluidnih komorah skupna z ohranjanjem prostorskih struktur enake velikosti, kot so mikrojame in površinski nizi [152,153,154].Predvsem kapljice so glavni odseki toka, ki jih je mogoče ustvariti in manipulirati tudi na nizih elektrod, ki temeljijo na digitalni mikrofluidiki (DMF).Elektromočenje dielektrikov je ena najbolje raziskanih teorij DMF, saj elektromočenje dielektrikov omogoča natančno manipulacijo posameznih kapljic, nadzorovanje oblike tekočine in asimetričnih električnih signalov, ki prehajajo skozi različne strani [141, 144].Glavne operacije s kapljicami v DMF vključujejo razvrščanje, cepitev in združevanje [151, 155, 156], ki se lahko uporabljajo na različnih področjih analize, zlasti pri molekularni detekciji [157, 158, 159].
Digitalna detekcija nukleinske kisline je tretja generacija molekularne diagnostične tehnologije, ki sledi konvencionalnemu PCR in kvantitativnemu PCR v realnem času (qPCR), vzporedno z visoko zmogljivim sekvenciranjem in tekočo biopsijo.V zadnjih dveh desetletjih so se digitalne nukleinske kisline hitro razvile na področju molekularne diagnostike infektivnih patogenov [160, 161, 162].Absolutna kvantifikacija digitalne detekcije nukleinske kisline se začne s pakiranjem vzorcev in reagentov v posamezne predelke, da se zagotovi, da ima vsako ciljno zaporedje enako verjetnost vstopa v vsak posamezen predelek.Teoretično je lahko vsakemu odseku dodeljenih več ciljnih sekvenc ali pa morda ne obstaja neodvisen mikroreakcijski sistem.Prek različnih mehanizmov zaznavanja, opisanih zgoraj, je predelke z mikrobnimi ciljnimi sekvencami, ki ustvarjajo signale nad določenim pragom, mogoče vizualizirati s prostim očesom ali s strojem in jih označiti kot pozitivne, medtem ko so druge predelke, ki ustvarjajo signale pod pragom, označene kot pozitivne .negativne, zaradi česar je signal za vsak odsek logična vrednost.Tako je mogoče z izračunom števila ustvarjenih predelkov in stopnje pozitivnih rezultatov po reakciji primerjati izvirne kopije preskusnih vzorcev z uporabo formule Poissonove porazdelitve brez potrebe po standardni krivulji, ki je potrebna za rutinske kvantitativne analize, kot je kot qPCR.[163] V primerjavi s tradicionalnimi molekularnimi diagnostičnimi metodami ima digitalna detekcija nukleinske kisline višjo stopnjo avtomatizacije, večjo hitrost analize in občutljivost, manj reagentov, manj kontaminacije ter preprostejšo zasnovo in izdelavo.Zaradi teh razlogov je bila uporaba digitalnih testov, zlasti metod, ki temeljijo na kapljicah, za molekularno diagnostiko, ki združuje tehnike ojačanja in odčitavanja signala, med kritičnim izbruhom SARS-CoV-2 dobro raziskana.Na primer, Yin et al.[164] so kombinirali digitalne kapljične in hitre metode PCR za odkrivanje genov ORF1ab, N in RNase P v SARS-CoV-2 v mikrofluidnem čipu.Predvsem je sistem uspel prepoznati pozitiven signal v 115 sekundah, kar je hitreje kot običajni PCR, kar kaže na njegovo učinkovitost pri odkrivanju na mestu oskrbe (slika 7a).Dong et al.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] in Alteri et al.[167] sta uporabila tudi kapljični digitalni PCR (ddPCR) za odkrivanje SARS-CoV-2 v mikrofluidnem sistemu z impresivnimi rezultati.Za nadaljnje izboljšanje stopnje odkrivanja sta Shen et al.[168] so dosegli slikanje čipov na osnovi ddPCR v pičlih 15 s brez uporabe tehnik povezovanja slik, s čimer so pospešili tehnološki proces ddPCR od laboratorija do aplikacije.Uporabljajo se ne le metode termičnega pomnoževanja, kot je PCR, temveč tudi metode izotermnega pomnoževanja za poenostavitev reakcijskih pogojev in hiter odziv.Lu et al.[71] je razvil SlipChip za analizo kapljic, ki lahko v enem koraku ustvari kapljice različnih velikosti pri visoki gostoti in kvantificira nukleinske kisline SARS-CoV-2 z uporabo digitalne LAMP (slika 7b).Kot hitro razvijajoča se tehnologija ima lahko CRISPR tudi pomembno vlogo pri digitalnem odkrivanju nukleinske kisline s priročnim kolorimetričnim slikanjem brez potrebe po dodatnih barvah nukleinske kisline.Ackerman et al.razvil kombinatorno matrično reakcijo za multipleksno vrednotenje nukleinskih kislin.[158] so odkrili 169 virusov, povezanih s človekom, vključno s SARS-CoV-2, v kapljicah, ki so vsebovale reagente za odkrivanje nukleinske kisline na osnovi CRISPR-Cas13 v testu z mikrovdolbinicami (slika 7c).Poleg tega je mogoče v istem sistemu uporabiti izotermno ojačanje in tehnologijo CRISPR, da se združijo prednosti obeh.Park et al.[169] Digitalni test CRISPR/Cas12a je bil razvit v komercialnem mikrofluidnem čipu za odkrivanje ekstrahiranega in toplotno uničenega SARS-CoV-2 na podlagi enostopenjskega RT-RPA s krajšim in višjim zaznavanjem signala v ozadju. časovno razmerje., širši dinamični razpon in boljša občutljivost (slika 7d).Nekateri opisi teh primerov so podani v tabeli 3.
Tipična digitalna platforma za detekcijo nukleinskih kislin.a Potek dela s hitrim digitalnim PCR je sestavljen iz štirih ključnih korakov: priprava vzorca, porazdelitev reakcijske mešanice, postopek pomnoževanja in ciljna kvantifikacija (prilagojeno iz [164]).b Shematski prikaz analize kapljic SlipChip za nastanek kapljic pri visoki gostoti (prirejeno iz [71]).c CARMEN-Cas diagram poteka dela13 (prirejeno po [158]).d Pregled naprednega digitalnega odkrivanja virusov s CRISPR/Cas v enem loncu (prirejeno po [169]).W/O voda v olju, polidimetilsiloksan PDMS, verižna reakcija s polimerazo PCR, zbiranje podatkov DAQ, proporcionalni integralni derivat PID, reakcija kombinatorne matrike CARMEN za vrednotenje multiple nukleinske kisline, SARS-CoV-2, hud akutni respiratorni sindrom, koronavirus 2, RT Pomnoževanje reverzne transkriptaze rekombinaze polimeraze-RPA, signal S/B v ozadju
Čas objave: 15. september 2022
