Novice

Hvala, ker ste obiskali Nature.com.Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS.Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju).Medtem bomo za zagotovitev stalne podpore spletno mesto upodobili brez slogov in JavaScripta.
Metode encimskega bližinskega označevanja, ki temeljijo na aktiviranih estrih ali fenoksi radikalih, se pogosto uporabljajo za preslikavo subceličnih proteomov in beljakovinskih interaktorjev v živih celicah.Vendar so aktivirani estri manj reaktivni, kar ima za posledico širok radij označevanja, fenoksi radikali, ki nastanejo pri obdelavi s peroksidom, pa lahko motijo ​​redoks poti.Tukaj poročamo o metodi fotoaktivacije, odvisne od označevanja bližine (PDPL), ki je bila razvita z genetskim povezovanjem fotosenzibilizacijskega proteina miniSOG z beljakovino, ki nas zanima.Sprožen z modro svetlobo in nadzorovan s časom izpostavljenosti, nastane singletni kisik in nato se doseže prostorsko-časovno ločeno označevanje histidinskih ostankov z anilinsko sondo.Njegovo visoko zvestobo dokazujemo s preslikavo proteomov, specifičnih za organele.Vzporedna primerjava PDPL s TurboID kaže bolj specifično in celovito proteomsko pokritost PDPL.Nato smo uporabili PDPL za transkripcijski koaktivator BRD4 in E3 Parkin ligazo, povezan z boleznijo, in našli prej neznane interaktorje.S presejanjem čezmerne ekspresije sta bila identificirana dva neznana substrata, Ssu72 in SNW1, za Parkin, katerega razgradnjo posreduje pot vseprisotnosti-proteasoma.
Natančna karakterizacija proteinskih mrež je osnova številnih temeljnih celičnih procesov.Zato bo zelo natančno prostorsko-časovno kartiranje beljakovinskih interakcij zagotovilo molekularno osnovo za dešifriranje bioloških poti, patologije bolezni in prekinitev teh interakcij v terapevtske namene.V ta namen so zelo zaželene metode, ki lahko zaznajo časovne interakcije v živih celicah ali tkivih.Masna spektrometrija z afinitetnim čiščenjem (AP-MS) se je v preteklosti uporabljala za identifikacijo vezavnih partnerjev zanimivih proteinov (POI).Z razvojem kvantitativnih proteomskih metod je nastala Bioplex3.0, največja baza proteinskih mrež, ki temelji na AP-MS.Čeprav je AP-MS zelo močan, so koraki celične lize in redčenja v delovnem toku nagnjeni k šibkim in prehodnim vezavnim interakcijam in uvajajo artefakte po lizi, kot so lažni interakcijski pari, ki pred lizo nimajo razdeljenosti.
Za reševanje teh težav so bile razvite nenaravne aminokisline (UAA) z zamreževalnimi skupinami in platforme za encimsko bližnje označevanje (PL) (npr. APEX in BioID)5.Čeprav je bila metoda UAA uspešno uporabljena v številnih scenarijih in zagotavlja informacije o neposrednih proteinskih lepilih, je še vedno potrebna optimizacija mesta vstavitve UAA.Še pomembneje je, da gre za stehiometrično metodo označevanja, ki nima katalitičnega obrata dogodkov označevanja.Nasprotno pa encimske metode PL, kot je metoda BioID, spajajo izdelano biotinsko ligazo s POI7, ki nato aktivira biotin, da tvori reaktiven intermediat biotinil-AMP estra.Encim tako katalizira in sprosti aktiviran biotinski "oblak", ki označuje proksimalne ostanke lizina.Vendar pa BioID potrebuje več kot 12 ur, da pridobi zadosten označen signal, kar onemogoča njegovo uporabo s časovno ločljivostjo.Z uporabo usmerjene evolucije, ki temelji na prikazu kvasovk, je bil TurboID zasnovan na podlagi BioID, da je učinkovitejši, saj omogoča učinkovito označevanje z biotinom v 10 minutah, kar omogoča preučevanje bolj dinamičnih procesov.Ker je TurboID zelo aktiven in ravni endogenega biotina zadostujejo za označevanje z nizko vsebnostjo, postane označevanje ozadja potencialna težava, ko je potrebno močno izboljšano in časovno označevanje z dodatkom eksogenega biotina.Poleg tega so aktivirani estri slabo reaktivni (t1/2 ~5 min), kar lahko privede do velikega radija označevanja, zlasti po nasičenju sosednjih proteinov z biotinom 5. Pri drugem pristopu je genetska fuzija konstruirane askorbat peroksidaze (tj. fenolne radikale in omogoča označevanje beljakovin v eni minuti 9, 10. APEX se pogosto uporablja za identifikacijo subceličnih proteomov, membranskih proteinskih kompleksov in citosolnih signalnih proteinskih kompleksov 11, 12. Vendar pa lahko potreba po visokih koncentracijah peroksidov vpliva na redoks proteine ​​ali poti in moti celični procesi.
Tako bo nova metoda, ki je sposobna ustvariti bolj reaktivne supresijske vrste z označenim polmerom z visoko prostorsko in časovno natančnostjo, ne da bi bistveno motila celične poti, pomemben dodatek k obstoječim metodam. Med reaktivnimi vrstami je našo pozornost vzbudil singletni kisik zaradi kratke življenjske dobe in omejenega difuzijskega radija (t1/2 < 0,6 µs v celicah)13. Med reaktivnimi vrstami je našo pozornost vzbudil singletni kisik zaradi kratke življenjske dobe in omejenega difuzijskega radija (t1/2 < 0,6 µs v celicah)13. Med aktivnimi oblikami je treba opozoriti, da pritegne sinletni kisik iz njegovega kratkega časa življenja in omejenega radiusa difuzije (t1/2 < 0,6 mks v celicah)13. Med aktivnimi oblikami je našo pozornost pritegnil singletni kisik zaradi kratke življenjske dobe in omejenega difuzijskega radija (t1/2 < 0,6 µs v celicah)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Sredi aktivnih oblik naše pozornosti privlači singletni kisik iz njegovega kratkega časa življenja in omejenega radiusa difuzije (t1/2 < 0,6 mks v celicah). Med aktivnimi oblikami našo pozornost pritegne singletni kisik zaradi svoje kratke življenjske dobe in omejenega difuzijskega radija (t1/2 < 0,6 μs v celicah).Poročali so, da singletni kisik naključno oksidira metionin, tirozin, histidin in triptofan, zaradi česar je polaren 14,15 za pritrditev na sonde na osnovi amina ali tiola 16,17.Čeprav je bil singletni kisik uporabljen za označevanje RNA podceličnega predela, ostajajo strategije za ponovno uporabo endogenih označevalcev bližine POI neraziskane.Tukaj predstavljamo platformo, imenovano označevanje bližine, odvisno od fotoaktivacije (PDPL), kjer uporabljamo modro svetlobo za osvetlitev POI, spojenih s fotosenzibilizatorjem miniSOG, in sprožimo nastajanje singletnega kisika za oksidacijo proksimalnih ostankov, čemur sledijo modifikacije, ki vsebujejo amine, za oksidacijo kemičnih sond v vmesne žive celice..Preizkusili smo skupino kemičnih sond, da bi povečali specifičnost oznak, in identificirali mesta modifikacije z odprtim potekom dela proteomike.Vzporedna primerjava PDPL s TurboID kaže bolj specifično in celovito proteomsko pokritost PDPL.Ta pristop smo uporabili za organele specifične označevalce subceličnega proteoma in splošno identifikacijo proteoma vezavnih partnerjev za z rakom povezan epigenetski regulatorni protein BRD4 in s Parkinsonovo boleznijo povezano E3 ligazo Parkin, kar je potrdilo znano in neznano mrežo beljakovin interakcije..Sposobnost PDPL, da prepozna substrate E3 v velikih proteinskih kompleksih, predstavlja situacijo, kjer je potrebno prepoznavanje posrednih veziv.Dva neznana substrata parkina, posredovana z ubikvitinacijskim proteasomom, sta bila potrjena in situ.
Fotodinamična terapija (PDT)19 in laserska inaktivacija s pomočjo kromoforja (CALI)20, pri kateri svetlobno obsevanje s fotosenzibilizatorji ustvarja singletni kisik, lahko inaktivira ciljne proteine ​​ali povzroči celično smrt.Ker je singletni kisik zelo reaktivna snov s teoretično difuzijsko razdaljo približno 70 nm, je mogoče nadzorovati prostorsko omejeno oksidacijo okoli fotosenzibilizatorja.Na podlagi tega koncepta smo se odločili uporabiti singletni kisik, da bi dosegli natančno označevanje proteinskih kompleksov v živih celicah.Razvili smo kemoproteomski pristop PDPL za izpolnjevanje štirih funkcij: (1) katalizirati nastajanje aktivnega singletnega kisika, podobno encimskemu pristopu PL;(2) zagotoviti časovno ločeno označevanje ob sprožitvi svetlobe;(3) s spremembo (4) Izogibajte se uporabi endogenih kofaktorjev (kot je biotin) za zmanjšanje ozadja ali uporabi zelo motečih eksogenih reagentov (kot so peroksidi), da zmanjšate izpostavljenost celic okoljskemu stresu.
Fotosenzibilizatorje lahko razdelimo v dve kategoriji, vključno s fluoroforji z majhno molekulsko maso (npr. bengalska vrtnica, metilensko modro)22 in genetsko kodiranimi majhnimi proteini (npr. miniSOG, KillerRed)23.Da bi dosegli modularno zasnovo, smo razvili prvo generacijo platforme PDPL z dodajanjem proteinov fotosenzibilizatorjev (PS) v POI24,25 (slika 1a).Pri obsevanju z modro svetlobo singletni kisik oksidira proksimalne nukleofilne aminokislinske ostanke, kar ima za posledico polarnost umpolunga, ki je elektrofilna in lahko nadalje reagira z nukleofili aminske sonde16,17.Sonda je zasnovana z alkinskim ročajem, ki omogoča kemijo klikanja in poteg navzdol za karakterizacijo LC/MS/MS.
Shematski prikaz označevanja proteinskih kompleksov, posredovanih z miniSOG.Ko so izpostavljene modri svetlobi, celice, ki izražajo miniSOG-POI, ustvarijo singletni kisik, ki spremeni medsebojno delujoče beljakovine, ne pa tudi nevezavnih beljakovin.Vmesne produkte fotooksidacije prestrežejo relejne oznake aminske kemične sonde, da tvorijo kovalentne adukte.Alkinilna skupina na kemijski sondi omogoča kemijo klika za obogatitev s potegom navzdol, ki mu sledi kvantifikacija LC-MS/MS.b Kemijska struktura aminskih sond 1-4.c Reprezentativna analiza fluorescentnega gela mitohondrijskih lokaliziranih proteomskih markerjev, posredovanih z miniSOG, z uporabo sond 1-4 in relativne kvantifikacije na podlagi gelske denzitometrije.Razmerje med signalom in ozadjem kemičnih sond je bilo ocenjeno z negativnimi kontrolnimi poskusi brez modre svetlobe ali z uporabo celic HEK293T brez izražanja miniSOG.n = 2 biološko neodvisna vzorca.Vsaka pika predstavlja biološko repliko.d Reprezentativno odkrivanje in kvantifikacija PDPL z uporabo optimizirane sonde 3 v prisotnosti ali odsotnosti navedenih komponent PDPL, kot je c.n = 3 biološko neodvisni vzorci.Vsaka pika predstavlja biološko repliko.Središčne črte in brki predstavljajo povprečje in ± standardno odstopanje.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Konfokalno slikanje singletnega kisika z daleč rdečim Si-DMA madežem.Lestvica: 10 µm.Slikanje z gelom in konfokalni poskusi so bili neodvisno ponovljeni vsaj dvakrat s podobnimi rezultati.
Najprej smo testirali sposobnost zrelih fotosenzibilizatorjev miniSOG26 in KillerRed23, stabilno izraženih v HEK293T, za posredovanje označevanja propargilamina proteoma kot kemične sonde (dopolnilna slika 1a).Analiza fluorescence gela je pokazala, da je bilo označevanje celotnega proteoma doseženo z uporabo miniSOG in obsevanja z modro svetlobo, medtem ko pri KillerRed niso opazili nobenega vidnega produkta označevanja.Da bi izboljšali razmerje med signalom in ozadjem, smo nato preizkusili niz kemičnih sond, ki vsebujejo anilin (1 in 3), propilamin (2) ali benzilamin (4).Opazili smo, da imajo same celice HEK293T višji signal v ozadju v primerjavi z modro svetlobo brez, verjetno zaradi endogenega fotosenzibilizatorja riboflavina, flavin mononukleotida (FMN) 27. Kemični sondi 1 in 3 na osnovi anilina sta dali boljšo specifičnost, pri čemer je HEK293T stabilno izražal miniSOG v mitohondrijih in prikazal >8-kratno povečanje signala za sondo 3, medtem ko je sonda 2, uporabljena pri metodi označevanja RNA CAP-seq, prikazala le ~2,5- kratno povečanje signala, verjetno zaradi različnih preferenc reaktivnosti med RNA in beljakovinami (sl. 1b, c). Kemični sondi 1 in 3 na osnovi anilina sta dali boljšo specifičnost, pri čemer je HEK293T stabilno izražal miniSOG v mitohondrijih in prikazal >8-kratno povečanje signala za sondo 3, medtem ko je sonda 2, uporabljena pri metodi označevanja RNA CAP-seq, prikazala le ~2,5- kratno povečanje signala, verjetno zaradi različnih preferenc reaktivnosti med RNA in beljakovinami (sl. 1b, c).Kemični sondi 1 in 3 na osnovi anilina sta pokazali boljšo specifičnost: HEK293T, ki stabilno izraža miniSOG v mitohondrijih, kaže več kot 8-kratno povečanje signala za sondo 3, medtem ko sonda 2, uporabljena v metodi označevanja RNK CAP-seq, le kaže približno 2,5-kratno povečanje signala, verjetno zaradi različnih preferenc reaktivnosti med RNA in beljakovinami (sl. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性 ， HEK293T 在 线 粒体 中 稳定 表达 表达 MINISOG ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 ， 用 用 用 于 RNA 标记 方法 Cap-Seq 的 2 仅 显示 显示 显示2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好，(图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 特异性 特异性 ， HEK293T 在 粒体 中 稳定 表达 表达 MINISOG ， 探针 3 的 信号 增加 增加 增加> 8 倍 而 于 于 于 于 RNA 标记 CAP-EQ 的 2 仅 仅 ~ ~ ~ 2,5 -倍信号增加，可能是由于RNAKemični sondi 1 in 3 na osnovi anilina sta imeli boljšo specifičnost, HEK293T je stabilno izražal miniSOG v mitohondrijih, sonda 3 pa je imela več kot 8-kratno povečanje signala, medtem ko je sonda 2 za metodo označevanja CAP-seq RNA pokazala le ~2,5-kratno povečanje.v signalu, verjetno zaradi različnih reakcijskih preferenc med RNA in proteinom (sl. 1b, c).Poleg tega so bili testirani izomeri sonde 3 in hidrazinske sonde (sonde 5, 6, 7), kar je potrdilo optimizacijo sonde 3 (dodatna slika 1b, c).Podobno je analiza fluorescence v gelu pokazala druge optimizirane eksperimentalne parametre: valovno dolžino obsevanja (460 nm), koncentracijo kemične sonde (1 mM) in čas obsevanja (20 min) (dodatna slika 2a–c).Izpustitev katere koli komponente ali koraka v protokolu PDPL je povzročila pomemben obrat signala v ozadje (slika 1d).Predvsem je bilo označevanje beljakovin znatno zmanjšano v prisotnosti natrijevega azida ali troloksa, za katera je znano, da dušita singletni kisik.Prisotnost D2O, za katerega je znano, da stabilizira singletni kisik, poveča signal za označevanje.Da bi raziskali prispevek drugih reaktivnih kisikovih zvrsti k označevanju, so dodali manitol in vitamin C, da bi določili lovilca hidroksilnih oziroma superoksidnih radikalov, 18, 29, vendar ni bilo ugotovljeno, da bi zmanjšala označevanje.Dodajanje H2O2, vendar ne osvetlitev, ni povzročilo označevanja (dopolnilna slika 3a).Fluorescenčno slikanje singletnega kisika s sondami Si-DMA je potrdilo prisotnost singletnega kisika v žici HEK293T-miniSOG, ne pa tudi v originalni žici HEK293T.Poleg tega mitoSOX Red ni mogel zaznati proizvodnje superoksida po osvetlitvi (slika 1e in dopolnilna slika 3b) 30. Ti podatki močno kažejo, da je singletni kisik glavna reaktivna vrsta kisika, ki je odgovorna za poznejše proteomsko označevanje.Citotoksičnost PDPL je bila ocenjena, vključno z obsevanjem z modro svetlobo in kemičnimi sondami, in niso opazili pomembne citotoksičnosti (dopolnilna slika 4a).
Da bi preučili mehanizem označevanja in omogočili proteomsko identifikacijo proteinskih kompleksov z uporabo LC-MS/MS, moramo najprej ugotoviti, katere aminokisline so modificirane, in delta maso oznak sonde.Poročali so, da so metionin, histidin, triptofan in tirozin modificirani s singletnim kisikom 14,15.Potek dela TOP-ABPP31 integriramo z nepristranskim odprtim iskanjem, ki ga zagotavlja računalniška platforma FragPipe, ki temelji na MSFragger32.Po modifikaciji singletnega kisika in označevanju s kemično sondo je bila izvedena kemija klika z uporabo biotinske redukcijske oznake, ki je vsebovala cepljivi povezovalec, čemur je sledilo raztezanje z nevtravidinom in razgradnja s tripsinom.Modificiran peptid, ki je bil še vedno vezan na smolo, je bil fotocepljen za analizo LC-MS/MS (slika 2a in dodatni podatki 1).V celotnem proteomu je prišlo do velikega števila modifikacij z več kot 50 navedenimi ujemanji peptidne karte (PSM) (slika 2b).Presenetljivo smo opazili samo modifikacijo histidina, verjetno zaradi večje reaktivnosti oksidiranega histidina proti anilinskim sondam kot druge aminokisline.V skladu z objavljenim mehanizmom oksidacije histidina s singletnim kisikom21,33 predlagana delta-masna struktura +229 Da ustreza aduktu sonde 3 z 2-okso-histidinom po dveh oksidacijah, medtem ko je +247 Da produkt hidrolize +229 Da (dodatna slika 5).Vrednotenje spektra MS2 je pokazalo visoko zanesljivost identifikacije večine ionov y in b, vključno z identifikacijo modificiranih fragmentnih ionov (y in b) (slika 2c).Analiza konteksta lokalnega zaporedja PDPL-modificiranih histidinov je pokazala zmerno preferenco motiva za majhne hidrofobne ostanke na položajih ±1 (dopolnilna slika 4b).V povprečju je bilo identificiranih 1, 4 histidina na beljakovino, mesta teh markerjev pa so bila določena z analizo dostopne površine topil (SASA) in relativne razpoložljivosti topil (RSA) (dodatna slika 4c, d).
Nepristranski potek dela za preučevanje preostale selektivnosti z uporabo računalniške platforme FragPipe, ki jo poganja MSFragger.Cepljivi povezovalci se uporabljajo v Click kemiji, da omogočijo fotocepitev modificiranih peptidov iz streptavidinske smole.Začelo se je odprto iskanje za identifikacijo številnih sprememb in ustreznih ostankov.b Določite maso modifikacij, ki se pojavljajo v celotnem proteomu.Kartiranje peptidov PSM.c MS2 spektralna anotacija histidinskih mest, modificiranih s sondo 3. Kot reprezentativen primer je kovalentna reakcija s sondo 3 dodala +229,0938 Da modificirani aminokislini.d Test mutacije, ki se uporablja za testiranje markerjev PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) in PRDX1 (H10A, H81A, H169A) sta bila transfektirana s plazmidi divjega tipa za odkrivanje anti-Flag.e Sintetični peptid je reagiral s prečiščenim miniSOG v prisotnosti sonde 3 in ustrezni produkti z Δm +247 in +229 so bili opaženi v spektru LC-MS.f In vitro interakcije protein-protein, modelirane z oznako miniSOG-6xHis in protitelesom proti 6xHis.Antibiotin (streptavidin-HRP) in anti-mišja Western blot analiza kompleksov protiteles miniSOG-6xHis/anti-6xHis, označenih s sondo 3, odvisno od časa izpostavljenosti svetlobi.Oznake za posamezne proteine ​​so izražene z ustrezno molekulsko maso: lahka veriga protiteles LC, težka veriga protiteles HC.Ti poskusi so bili neodvisno ponovljeni vsaj dvakrat s podobnimi rezultati.
Za biokemično preverjanje mesta označevanja sta bila PRDX3 in PRDX1, identificirana z masno spektrometrijo, spremenjena iz histidina v alanin in primerjana z divjim tipom v testih transfekcije.Rezultati PDPL so pokazali, da je mutacija znatno zmanjšala označevanje (slika 2d).Medtem so bile peptidne sekvence, identificirane v odprtem iskanju, sintetizirane in reagirale in vitro s prečiščenim miniSOG v prisotnosti sonde 3 in modre svetlobe, pri čemer so nastali produkti s premikom mase +247 in +229 Da, ko jih je zaznala LC-MS (slika 2e).).Da bi preizkusili, ali bi lahko medsebojno delujoče proksimalne proteine ​​označili in vitro kot odziv na fotoaktivacijo miniSOG, smo zasnovali test umetne bližine z interakcijo med proteinom miniSOG-6xHis in anti-His monoklonskim protitelesom in vitro (slika 2f).V tem testu smo pričakovali proksimalno označevanje težkih in lahkih verig protiteles z miniSOG.Dejansko sta anti-mišji (prepoznavanje težkih in lahkih verig protitelesa, označenega z anti-6xHis) in streptavidin Western blot pokazala močno biotinilacijo težke in lahke verige.Predvsem smo opazili avtobiotinilacijo miniSOG zaradi oznake 6xHis in navzkrižnih povezav med lahkimi in težkimi verigami, kar je lahko povezano s prej opisano vrzeljo med proksimalnim odzivom lizina in 2-okso-histidina.Na koncu sklepamo, da PDPL spreminja histidin na način, ki je odvisen od bližine.
Naš naslednji cilj je bil karakterizirati podcelični proteom, da bi testirali specifičnost označevanja in situ.Zato smo stabilno izrazili miniSOG v jedru, mitohondrijskem matriksu ali zunanji membrani ER celic HEK293T (slika 3a).Analiza fluorescence gela je razkrila obilne označene pasove na treh podceličnih lokacijah kot tudi različne vzorce označevanja (slika 3b).Analiza fluorescenčnega slikanja je pokazala visoko specifičnost PDPL (slika 3c).Poteku dela PDPL so sledile reakcije klikanja z rodaminskimi barvili za razmejitev podceličnih proteomov s fluorescenčno mikroskopijo, signali PDPL pa so bili kolokalizirani z DAPI, mitohondrijskimi sledilci ali ER sledilci, kar je potrdilo visoko zvestobo PDPL.Za tri lokacije organelov je vzporedna primerjava PDPL s TurboID z uporabo avidin western blota pokazala, da je bil PDPL označen natančneje v primerjavi z njihovimi kontrolami.V pogojih PDPL se je pojavilo več označenih pasov, kar kaže na več proteinov, označenih s PDPL (dodatna slika 6a-d).
Shematski prikaz označevanja proteoma, specifičnega za organele, posredovanega z miniSOG.miniSOG cilja na mitohondrijski matriks s fuzijo na N-terminalne 23 aminokislin človeškega COX4 (mito-miniSOG), jedro s fuzijo na H2B (nucleus-miniSOG) in Sec61β preko citoplazemske strani membrane ER (ER-miniSOG ).Indikacije vključujejo slikanje z gelom, konfokalno slikanje in masno spektrometrijo.b Reprezentativne slike gela treh profilov PDPL, specifičnih za organele.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Reprezentativne konfokalne slike celic HEK293T, ki stabilno izražajo miniSOG z različnimi podceličnimi lokalizacijami, ki jih zazna protitelo, označeno z V5 (rdeče).Subcelični markerji se uporabljajo za mitohondrije in ER (zeleno).Potek dela PDPL vključuje detekcijo podceličnih proteomov, označenih z miniSOG (rumeno), z uporabo kemije klikov Cy3-azida.Lestvica: 10 µm.d Vulkanske ploskve proteomov, označenih s PDPL, v različnih organelih, kvantificiranih z neoznačeno kvantifikacijo (n = 3 neodvisni biološki poskusi).Dvostranski Studentov t-test je bil uporabljen za vulkanske ploskve.Divji tip HEK293T je bil uporabljen kot negativna kontrola. Bistveno spremenjene beljakovine so označene rdeče (p <0,05 in >2-kratna razlika v intenzivnosti ionov). Bistveno spremenjene beljakovine so označene rdeče (p <0,05 in >2-kratna razlika v intenzivnosti ionov). Značajno spremenjene bele barve so označene z rdečim cvetom (p < 0,05 in >2-kratna stopnja intenzivnosti ionov). Bistveno spremenjene beljakovine so označene rdeče (p < 0,05 in > 2-kratna razlika v intenzivnosti ionov).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Značajno spremenjene bele barve so označene z rdečo barvo (p < 0,05 in > 2-kratna raznica v ionski barvi). Bistveno spremenjene beljakovine so označene rdeče (p < 0,05 in > 2-kratna razlika v ionski moči).Sorodni proteini, pomembni za HEK293T-miniSOG, vendar nepomembni za HEK293T, so prikazani zeleno.e Analiza specifičnosti proteomskih podatkovnih nizov iz eksperimentov d.Na vrhu je označeno skupno število statistično značilnih proteinov v posameznem organelu (rdeče in zelene pike).Histogrami prikazujejo proteine, lokalizirane v organelih na podlagi MitoCarta 3.0, analize GO in A. Ting et al.ljudi.Ločeni nabori podatkov za mitohondrije, jedra in ER.Ti poskusi so bili neodvisno ponovljeni vsaj dvakrat s podobnimi rezultati.Neobdelani podatki so na voljo v obliki neobdelanih podatkovnih datotek.
Ob spodbudi rezultatov gela in slikanja je bila kvantifikacija brez nalepk uporabljena za kvantifikacijo identificiranega proteoma v vsaki organeli (dodatni podatki 2).Netransfektirani HEK293T je bil uporabljen kot negativna kontrola za odštevanje markerjev ozadja. Analiza grafa vulkana je pokazala znatno obogatene beljakovine (p <0,05 in > 2-kratna ionska intenzivnost) kot tudi enojne beljakovine, ki so prisotne samo v linijah, ki izražajo miniSOG (slika 3d rdeče in zelene pike). Analiza grafa vulkana je pokazala znatno obogatene beljakovine (p <0,05 in > 2-kratna ionska intenzivnost) kot tudi enojne beljakovine, ki so prisotne samo v linijah, ki izražajo miniSOG (slika 3d rdeče in zelene pike). Analiza grafikona vulkana je pokazala precej obogatene bele (p <0, 05 in > 2-kratna intenzivnost ionov), kot tudi posamezne bele, ki so prisotne samo v linijah, ki izražajo miniSOG (ris. 3d, rdeče in zelene točke). Analiza vulkanske ploskve je pokazala znatno obogatene beljakovine (p<0,05 in >2-kratna ionska intenzivnost) kot tudi posamezne beljakovine, ki so prisotne le v linijah, ki izražajo miniSOG (slika 3d, rdeče in zelene pike).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 （（P <0,05 和> 2 倍 离子 强度）） 以及 仅 存 在于 Minisog 表达 系 中 的 单一 单一 蛋白质 （图 图 3d 红色 和 绿色点 绿色点。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （（P <0,05 和> 2 倍 离子 强度）））） 存 在于 在于 Minisog 表达 系 的 单一 单一 （（图 图 3d 红色 绿色点 。。。））） čida Analiza grafa vulkana je odkrila zelo obogatene bele (p <0, 05 i> 2x ionska sila), kot tudi ločene bele, ki so prisotne samo v ekspresijski liniji miniSOG (rdeče in zelene točke na sliki 3d). Analiza vulkanske ploskve je pokazala znatno obogatene beljakovine (p<0,05 in >2x ionska moč) kot tudi posamezne beljakovine, ki so prisotne samo v ekspresijski liniji miniSOG (rdeče in zelene pike na sliki 3d).Z združevanjem teh podatkov smo identificirali 1364, 461 in 911 statistično pomembnih jedrskih, mitohondrijskih in ER zunanjih membranskih proteinov.Za analizo točnosti PDPL, lokaliziranega na organele, smo uporabili MitoCarta 3.0, analizo genske ontologije (GO) in A. Ting et al.nabor podatkov8 je bil uporabljen za mitohondrije, jedro in ER za testiranje specifičnosti organelov zaznanih proteinov, kar ustreza natančnosti 73,4, 78,5 in 73,0 % (slika 3e).Specifičnost PDPL potrjuje, da je PDPL idealno orodje za identifikacijo proteomov, specifičnih za organele.Predvsem je submitohondrijska analiza identificiranih mitohondrijskih proteinov pokazala, da je bil ujeti proteom večinoma porazdeljen v matriksu in notranji membrani (226 oziroma 106), kar predstavlja 91,7 % (362) skupnega števila identificiranih mitohondrijskih proteinov.visoka raven PDPL je bila dodatno potrjena (dopolnilna slika 7a).Podobno je subnuklearna analiza pokazala, da je bil zajeti proteom večinoma porazdeljen v jedru, nukleoplazmi in nukleolu (dopolnilna slika 7b).Jedrska proteomska analiza z jedrskim lokalizacijskim signalnim peptidom (3xNLS) je pokazala podobno natančnost kot konstrukt H2B (dopolnilna slika 7c-h).Za določitev specifičnosti markerja PDPL je bil jedrski laminin A izbran kot bolj diskretno lokalizirana past POI7.PDPL je identificiral 36 bistveno obogatenih proteinov, od katerih je bilo 12 proteinov (30,0 % vključno z laminom A) dobro karakteriziranih proteinov, ki medsebojno delujejo z laminom A, označenih z bazo podatkov String, z višjim odstotkom kot pri metodi BioID (122 proteinov) 28 od 28. , 22,9 %) 7. Naša metoda je identificirala manj beljakovin, verjetno zaradi omejenih območij označevanja, kar je omogočilo več aktivnega singletnega kisika.Analiza GO je pokazala, da so bili identificirani proteini večinoma locirani v nukleoplazmi (26), jedrski membrani (10), jedrski membrani (9) in jedrskih porah (5).Skupaj so ti jedrsko lokalizirani proteini predstavljali 80% obogatenih proteinov, kar je dodatno pokazalo specifičnost PDPL (dodatna slika 8a–d).
Ko smo ugotovili sposobnost PDPL za izvajanje označevanja bližine v organelih, smo nato preizkusili, ali bi lahko PDPL uporabili za analizo partnerjev, ki vežejo POI.Zlasti smo poskušali definirati PDPL analizo citosolnih proteinov, ki zaradi svoje zelo dinamične narave veljajo za težje tarče kot njihovi membransko lokalizirani primerki.Bromodomena in ekstraterminalni (BET) protein BRD4 sta pritegnila našo pozornost zaradi svoje ključne vloge pri različnih boleznih 35, 36.Kompleks, ki ga tvori BRD4, je transkripcijski koaktivator in pomembna terapevtska tarča.Z uravnavanjem izražanja transkripcijskih faktorjev c-myc in Wnt5a se domneva, da je BRD4 ključna determinanta akutne mieloične levkemije (AML), multiplega mieloma, Burkittovega limfoma, raka debelega črevesa in vnetnih bolezni 37,38.Poleg tega nekateri virusi ciljajo na BRD4 za uravnavanje virusne in celične transkripcije, kot so papilomavirus, HIV in SARS-CoV-236,39.
Za preslikavo interakcije BRD4 z uporabo PDPL smo združili miniSOG s kratko N- ali C-terminalno izoobliko BRD4.Proteomski rezultati so pokazali visoko stopnjo prekrivanja med obema konstruktoma (dopolnilna slika 9a).Jedrski proteom, identificiran z miniSOG-H2B, pokriva 77,6% beljakovin, ki medsebojno delujejo z BRD4 (dodatna slika 9b).Nato so bili uporabljeni različni časi osvetlitve (2, 5, 10, 20 min) za nastavitev polmera markerja (slika 4a in dodatni podatki 3).Sklepamo, da bo pri krajših obdobjih fotoaktivacije PDPL označil predvsem neposredne vezavne partnerje, medtem ko bodo daljša obdobja vključevala proteine, identificirane med krajšimi obdobji fotoaktivacije, kot tudi posredne tarče v kompleksih za označevanje.Pravzaprav smo ugotovili močno prekrivanje med sosednjimi časovnimi točkami (84,6 % za 2 in 5 min; 87,7 % za 5 in 10 min; 98,7 % za 10 in 20 min) (slika 4b in dopolnilna slika 9c).V vseh poskusnih skupinah nismo našli le samooznačevanja BRD4, ampak več znanih tarč, kot so MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A in HMGB1, označenih v zbirki podatkov nizov.Ionska moč teh tarč je sorazmerna s časom izpostavljenosti (slika 4c in dopolnilna slika 9d).GO analiza proteinov, identificiranih v 2-minutni skupini, je pokazala, da so bili identificirani proteini lokalizirani v jedru in so bili vključeni v preoblikovanje kromatina in delovanje RNA polimeraze.Molekularna funkcija proteina je bila obogatena z vezavo kromatina ali transkripcijsko koaktivacijo, skladno s funkcijo BRD4 (slika 4d).Analiza interakcij proteinov, omogočena s podatkovno bazo nizov, je pokazala prvo raven posrednih interakcij med BRD4 in HDAC družinsko interakcijskimi kompleksi, kot so SIN3A, NCOR2, BCOR in SAP130 (slika 4e in dopolnilna slika 9e), skladno z BRD4 in HDAC, ki vežeta acetilirane histone ..Poleg tega so bile reprezentativne tarče, identificirane z LC-MS/MS, vključno s Sin3A, NSUN2, Fus in SFPQ, potrjene z Western blottingom (slika 4f).Pred kratkim so poročali, da kratka izooblika BRD4 tvori jedra z lastnostmi ločevanja tekočih in tekočih faz (LLPS).Proteina, ki vežeta RNA, Fus in SFPQ posredujeta LLPS različnih celičnih procesov in sta bila tukaj identificirana kot nezabeleženi vezavni protein BRD4.Interakcija med BRD4 in SFPQ je bila potrjena s poskusi ko-imunoprecipitacije (co-IP) (slika 4g), kar kaže na drug mehanizem za BRD4 posredovano ločevanje tekoče-tekoče faze, ki si zasluži nadaljnjo preiskavo.Ti rezultati skupaj kažejo, da je PDPL idealna platforma za identifikacijo znanih interakcij BRD4 in neznanih vezavnih proteinov.
Shematski prikaz bližinskega označevanja BRD4, posredovanega z miniSOG, časi izpostavljenosti: 2, 5, 10 in 20 min.b Prekrivanje proteinov, identificiranih pri različnih časih osvetlitve.Obogatitev beljakovin, ugotovljena v HEK293T-miniSOG-BRD4, je bila statistično pomembna v primerjavi z divjim tipom HEK293T.c Intenzivnost ionov pri kvantificiranju neoznačenih reprezentativnih znanih proteinov, ki vežejo BRD4, v določenem času izpostavljenosti.n = 3 biološko neodvisni vzorci.Podatki so predstavljeni kot povprečje ± standardni odklon.d Genska ontološka analiza (GO) proteinov, identificiranih v 2-minutni skupini.Naštetih je prvih deset izrazov GO.Mehurčki so obarvani glede na kategorijo izrazov GO, velikost mehurčkov pa je sorazmerna s številom beljakovin, najdenih v vsakem izrazu.e Analiza nizov proteinov, ki medsebojno delujejo z BRD4.Rumeni krogi so neposredno lepilo, sivi krogi pa prvi sloj posrednega lepila.Rdeče črte predstavljajo eksperimentalno določene interakcije, modre črte pa predvidene interakcije.f Reprezentativne tarče vezave BRD4, identificirane v LC-MS/MS, so bile preverjene z Western blottingom.g Poskusi soimunoprecipitacije potrjujejo interakcijo med SFPQ in BRD4.Ti poskusi so bili neodvisno ponovljeni vsaj dvakrat s podobnimi rezultati.Neobdelani podatki so na voljo v obliki neobdelanih podatkovnih datotek.
Poleg identifikacije neregistriranih ciljev, povezanih s POI, domnevamo, da bo PDPL primeren za identifikacijo substratov za encime, kar bi zahtevalo karakterizacijo posredno vezavnih proteinov v velikih kompleksih za označevanje neregistriranih substratov.Parkin (kodiran s PARK2) je ligaza E3 in znano je, da mutacije v parkinu povzročajo avtosomno recesivno juvenilno Parkinsonovo bolezen (AR-JP)42.Poleg tega je bil parkin opisan kot nujen za mitofagijo (mitohondrijsko avtofagijo) in odstranjevanje reaktivnih kisikovih vrst.Čeprav je bilo identificiranih več substratov parkina, ostaja vloga parkina pri tej bolezni nejasna.Za označevanje njegovih neopredeljenih substratov je bil PDPL testiran z dodajanjem miniSOG na N- ali C-konec parkina.Celice smo obdelali s karbonil cianidnim protonskim prenašalcem m-klorofenilhidrazonom (CCCP), da aktiviramo parkin preko poti PINK1-Parkin.V primerjavi z našimi rezultati BRD4 PDPL je fuzija N-terminusa parkina razkrila večji niz ciljnih proteinov, čeprav je zajela večji del C-konca (177 od 210) (slika 5a, b in dodatni podatki 4).rezultat je skladen s poročili, da lahko N-terminalne oznake nenormalno aktivirajo Parkin44.Presenetljivo je bilo v naših podatkih z objavljenimi rezultati AP-MS za Parkin43 samo 18 prekrivajočih se proteinov, verjetno zaradi razlik med celičnimi linijami in poteki dela proteomike.Poleg štirih znanih proteinov (ARDM1, HSPA8, PSMD14 in PSMC3), identificiranih z dvema metodama (slika 5c)43.Za nadaljnjo validacijo rezultatov LC-MS/MS sta bila uporabljena obdelava PDPL in kasnejši Western blot za primerjavo rezultatov testa matičnih celic HEK293T in stabilne N-terminalne parkin linije.Prej neznane tarče CDK2, DUT, CTBP1 in PSMC4 so bile testirane z znanim vezivom, DNAJB1 (slika 5d).
Vulkanski prikaz proteinov, ki medsebojno delujejo s parkinom, v celicah HEK293T s stabilno izraženim miniSOG, spojenim z N- ali C-koncem parkina (n = 3 neodvisni biološki poskusi).Dvostranski Studentov t-test je bil uporabljen za vulkanske ploskve.HEK293T je bil uporabljen kot negativna kontrola. Bistveno spremenjene beljakovine so označene rdeče (p <0,05 in >2-kratna razlika v intenzivnosti ionov). Bistveno spremenjene beljakovine so označene rdeče (p <0,05 in >2-kratna razlika v intenzivnosti ionov). Značajno spremenjene bele barve so označene z rdečim cvetom (p < 0,05 in >2-kratna stopnja intenzivnosti ionov). Bistveno spremenjene beljakovine so označene rdeče (p < 0,05 in > 2-kratna razlika v intenzivnosti ionov).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Značajno spremenjene bele barve so označene z rdečo barvo (p < 0,05 in > 2-kratna raznica v ionski barvi). Bistveno spremenjene beljakovine so označene rdeče (p < 0,05 in > 2-kratna razlika v ionski moči).Sorodni proteini, pomembni za HEK293T-miniSOG, vendar nepomembni za HEK293T, so prikazani zeleno.b Vennov diagram, ki prikazuje prekrivajoče se proteine ​​med N-terminalnimi in C-terminalnimi konstrukti.N-terminalne oznake lahko nenormalno aktivirajo parkin in povzročijo bolj prepoznavne beljakovine.c Vennov diagram, ki prikazuje prekrivajoče se proteine ​​med PDPL in AP-MS.Našteti so znani interaktorji, vključno s 4 od 18 prekrivajočih se proteinov in 11 od 159 proteinov, ki so posebej identificirani v PDPL.d Reprezentativne tarče, identificirane z LC-MS/MS, so bile preverjene z Western blottingom.e Ssu72 in SNW1 sta bila identificirana kot neregistrirana substrata parkina.Ti proteinski plazmidi, označeni s FLAG, so bili transfektirani v HEK293T in HEK293T-Parkin-miniSOG, čemur je sledilo zdravljenje s CCCP v različnih časovnih točkah.Razgradnja je bila bolj izrazita v Parkinovi prekomerni liniji.f Z uporabo zaviralca proteasoma MG132 je bilo potrjeno, da je proces razgradnje Ssu72 in SNW1 posredovan z vseprisotnostjo proteasoma.Ti poskusi so bili neodvisno ponovljeni vsaj dvakrat s podobnimi rezultati.Neobdelani podatki so na voljo v obliki neobdelanih podatkovnih datotek.
Predvsem morajo proteini, ki jih identificira PDPL, vključevati proteine, ki vežejo parkin, in njihove substrate.Za odkrivanje neregistriranih substratov parkina smo izbrali sedem identificiranih proteinov (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 in SNW1) in transfektirane plazmide, da smo te gene izpostavili normalnemu HEK293T in stabilno izražali miniSOG-Parkin HEK293T, čemur je sledilo zdravljenje s CCCP.Ravni proteinov Ssu72 in SNW1 so bile znatno znižane v stabilni liniji miniSOG-Parkin (slika 5e).Obdelava s CCCP za 12 ur je povzročila najpomembnejšo degradacijo obeh substratov.Da bi raziskali, ali je razgradnja Ssu72 in SNW1 regulirana z vseprisotnostjo proteasoma, je bil dodan zaviralec proteasoma MG132, da zavira aktivnost proteasoma, in dejansko smo ugotovili, da je bil njihov proces razgradnje inhibiran (slika 5f).Dodatne ne-substratne tarče so bile potrjene kot Parkin interaktorji z uporabo Western blottinga (dodatna slika 10), ki je pokazala skladne rezultate z LC-MS/MS.Skratka, integracija delovnega toka PDPL s preverjanjem transfekcije ciljnega proteina omogoča identifikacijo neregistriranih substratov ligaze E3.
Razvili smo skupno platformo za označevanje bližine, ki vam omogoča prepoznavanje zanimivih točk v prostoru in času.Platforma temelji na fotosenzibilizacijskem proteinu miniSOG, ki je le približno 12 kDa, kar je manj kot polovica velikosti zrelega encima APEX2 (27 kDa) in ena tretjina velikosti TurboID (35 kDa).Manjša velikost bi morala močno razširiti obseg aplikacij za preučevanje majhnih proteinskih interaktomov.Za povečanje kvantnega izkoristka singletnega kisika in razširitev občutljivosti tega pristopa je potrebno nadaljnje raziskovanje dodatnih fotosenzibilizatorjev, bodisi gensko kodiranih proteinov ali majhnih molekul.Za trenutno različico miniSOG je mogoče doseči visoko časovno ločljivost z uporabo modre osvetlitve za aktiviranje označevalcev bližine.Poleg tega je daljši čas izpostavljenosti sprostil večji "oblak" singletnega kisika, kar je povzročilo modifikacijo bolj distalnih ostankov histidina, povečan radij označevanja in možnost natančnega prilagajanja prostorske ločljivosti PDPL.Preizkusili smo tudi sedem kemičnih sond za povečanje razmerja med signalom in ozadjem ter raziskali molekularni mehanizem za tem pristopom.Delovni tok TOP-ABPP v kombinaciji z nepristranskim odprtim iskanjem je potrdil, da so se spremembe pojavile samo v histidinih in da ni bilo opaziti doslednega mikrookolja za povečane modifikacije histidina, razen zmerne preference za histidine v območju zanke.
PDPL je bil uporabljen tudi za karakterizacijo subceličnih proteomov s specifičnostjo proteoma in pokritostjo, ki je vsaj primerljiva z drugimi metodami bližinskega označevanja in kemičnih sond, specifičnih za organele.Označevalci bližine so bili tudi uspešno uporabljeni za karakterizacijo površinskih, lizosomskih in s sekretomom povezanih proteomov 46, 47.Verjamemo, da bo PDPL združljiv s temi podceličnimi organeli.Poleg tega smo izpodbijali PDPL z identifikacijo tarč za vezavo citosolnih beljakovin, ki so zaradi svojih dinamičnih lastnosti in vpletenosti v bolj časovne interakcije bolj zapletene od membransko vezanih beljakovin.PDPL smo uporabili za dva proteina, transkripcijski koaktivator BRD4 in z boleznijo povezano ligazo E3 Parkin.Ta dva proteina nista bila izbrana le zaradi njunih temeljnih bioloških funkcij, ampak tudi zaradi njunega kliničnega pomena in terapevtskega potenciala.Za ti dve POI so bili identificirani dobro znani zavezujoči partnerji in neregistrirani cilji.Predvsem je bil protein SFPQ, povezan z ločevanjem faz, potrjen s co-IP, kar lahko kaže na nov mehanizem, s katerim BRD4 (kratka izoforma) uravnava LLPS.Hkrati menimo, da je identifikacija Parkin substratov scenarij, v katerem je potrebna identifikacija indirektnih lepil.Identificirali smo dva neidentificirana substrata parkina in potrdili njuno razgradnjo po poti ubikvitinacije-proteasoma.Nedavno je bila razvita strategija lovljenja, ki temelji na mehanizmu, za odkrivanje substratov hidrolaze z lovljenjem z encimi.Čeprav je to zelo močna metoda, ni primerna za analizo substratov, ki sodelujejo pri tvorbi velikih kompleksov, in zahteva tvorbo kovalentnih vezi med encimom in substratom.Pričakujemo, da se lahko PDPL razširi na študij drugih proteinskih kompleksov in družin encimov, kot sta družini deubikvitinaz in metaloproteaz.
Nova oblika miniSOG, imenovana SOPP3, je bila razvita z izboljšano proizvodnjo singletnega kisika.Primerjali smo miniSOG s SOPP3 in ugotovili izboljšano zmogljivost označevanja, čeprav je razmerje med signalom in šumom ostalo nespremenjeno (dopolnilna slika 11).Domnevali smo, da bi optimizacija SOPP3 (npr. z usmerjeno evolucijo) vodila do učinkovitejših fotosenzibilizacijskih proteinov, ki zahtevajo krajše svetlobne čase in tako omogočajo zajem bolj dinamičnih celičnih procesov.Predvsem je trenutna različica PDPL omejena na celično okolje, saj zahteva osvetlitev z modro svetlobo in ne more prodreti v globoka tkiva.Ta lastnost izključuje njegovo uporabo v študijah na živalskih modelih.Vendar pa bi lahko kombinacija optogenetike s PDPL ponudila priložnost za raziskave na živalih, zlasti v možganih.Poleg tega drugi infrardeči fotosenzibilizatorji prav tako odpravijo to omejitev.Na tem področju trenutno potekajo raziskave.
Celična linija HEK293T je bila pridobljena iz ATCC (CRL-3216).Celična linija je bila negativna na okužbo z mikoplazmo in je bila gojena v DMEM (Thermo, #C11995500BT), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (FBS, Vistech, #SE100-B) in 1% penicilina/streptomicina (Hyclone, #SV30010).odrasel v.
3-aminofenilen (vzorec 3) in (4-etinilfenil)metanamin (vzorec 4) sta bila kupljena pri Bidepharmu.Propilamin (sonda 2) je bil kupljen pri Energy-chemicals.N-(2-aminofenil)pent-4-inamid (sonda 1) smo sintetizirali po objavljenih metodah.
V dodatni tabeli 1 so navedeni genetski konstrukti, uporabljeni v tej študiji.Sekvenci miniSOG in KillerRed sta bili klonirani iz darilnega plazmida P. Zou (Univerza v Pekingu).Ciljno zaporedje mitohondrijskega matriksa je bilo pridobljeno iz 23 N-terminalnih aminokislin COX4 in klonirano v navedene vektorje z uporabo Gibsonovega sklopa (Beyotime, #D7010S).Za ciljanje na membrano in jedro endoplazmatskega retikuluma sta človeška DNA SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L), pomnožena s PCR iz knjižnice cDNA celic HEK293T, in DNA H2B (donator D. Lin, laboratorij Shenzhen Bay) in kloniran, kot je navedeno zgoraj.Če ni drugače navedeno, so bili drugi proteinski geni, uporabljeni za transfekcijo in konstrukcijo stabilnih celičnih linij, pomnoženi s PCR iz knjižnice cDNA celic HEK293T.G3S (GGGS) in G4S (GGGGS) sta bila uporabljena kot povezovalca med proteinom vabe in miniSOG.Tem fuzijskim konstruktom je bila dodana oznaka epitopa V5 (GKPIPNPLLGLDST).Za izražanje pri sesalcih in vzpostavitev stabilne celične linije je bil fuzijski konstrukt miniSOG subkloniran v lentivirusni vektor pLX304.Za bakterijsko izražanje je bil miniSOG kloniran v vektor pET21a, označen s 6xHis na C-koncu.
Celice HEK293T smo zasejali z 2,0 x 105 celic na vdolbino v ploščah s šestimi vdolbinicami in jih 24 ur kasneje transficirali z rekombinantnimi lentivirusnimi plazmidi (2,4 μg pLX304) in plazmidi za pakiranje virusov (1,5 μg psPAX2 in 1,2 μg pMD2.G) z uporabo Lipo8000 (Beyotime). , #C0533), približno 80 % fuzije.Po nočni transfekciji smo medij zamenjali in inkubirali še 24 ur.Odvzem virusa je bil izveden po 24, 48 in 72 urah.Pred okužbo tarčnih celičnih linij smo virusni medij filtrirali skozi 0,8 μm filter (Merck, #millex-GP) in dodali polibrene (Solarbio, #H8761) do koncentracije 8 μg/ml.Po 24 urah so celice pustili, da so si opomogle s spremembo medija.Celice so bile izbrane z uporabo 5 μg/ml blasticidina (Solarbio, #3513-03-9) za prve tri prehode kot nižja stroga selekcija.Nato uporabili 20 μg/ml kot strožji režim za naslednje tri prehode.
Celice smo zasejali v komore z 12 vdolbinicami (Ibidi, #81201) pri gostoti približno 20.000 celic na vdolbinico.Za izboljšanje adhezije celic HEK293T dodajte 50 µg/ml fibronektina (Corning, #356008), razredčenega v fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom (PBS, Sangon, #B640435) pri 37 °C.Komore so bile predhodno obdelane 1 uro in nato odstranjene s PBS.Po 24 urah celice enkrat speremo s PBS, inkubiramo z 1 mM sondo 3 v sveži Hanksovi uravnoteženi raztopini soli (HBSS, Gibco, #14025092) 1 uro pri 37 °C in nato inkubiramo z modro LED (460 nm). ).) smo obsevali 10 minut pri sobni temperaturi.Po tem smo celice dvakrat sprali s PBS in fiksirali s 4% formaldehidom v PBS (Sangon, #E672002) 15 minut pri sobni temperaturi.Presežek formaldehida smo odstranili iz fiksnih celic s trikratnim izpiranjem s PBS.Celice smo nato permeabilizirali z 0,5 % Triton X-100 (Sangon, #A600198) v PBS in 3-krat sprali s PBS.Nato odstranite komoro in vsakemu vzorcu dodajte 25 µl klik reakcijske zmesi, ki vsebuje 50 µM Cy3-azida (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4). in 0,5 mg/ml natrijevega askorbata (Aladdin, št. S105024) in inkubirali 30 minut pri sobni temperaturi.Po hitri reakciji celice šestkrat speremo s PBS, ki vsebuje 0,05 % Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) in nato blokiramo s 5 % BSA (Abcone, #B24726) v PBST 30 minut pri sobni temperaturi.
Za kolokalizacijsko imunsko barvanje smo celice inkubirali s primarnimi protitelesi v skladu z navedenimi pogoji: mišje anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), kunčje anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), zajčje poliklonsko protitelo proti kalneksinu (1:500, Abcam, #ab22595) ali zajčje monoklonsko protitelo proti lamin A/C (1:500; CST, #2032) pri 4 °C čez noč.Po 3-kratnem izpiranju s PBST smo celice inkubirali s sekundarnimi protitelesi: kozjim anti-kunčjim Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034), razredčenim 1:1000, kozjim anti-mišjim Alexa Fluor 594 (CST, #8889), razredčenim 1:1000.redčenje. Redčite pri sobni temperaturi 30 minut.Celice smo nato 3-krat sprali s PBST in protibarvali z DAPI (Thermo, #D1306) v PBS 10 minut pri sobni temperaturi.Po 3 izpiranjih s PBS so bile celice zaprte v 50% glicerolu (Sangon, #A600232) v PBS za slikanje.Imunofluorescenčne slike so bile pridobljene z uporabo konfokalnega mikroskopa ZEISS LSM 900 Airyscan2 in programske opreme ZNE 3.5.
Za fluorescentno slikanje s singletnim kisikom smo celice dvakrat sprali s pufrom Hanks HEPES, preden smo dodali 100 nM Si-DMA v pufru Hanks HEPES (DOJINDO, #MT05).Po izpostavitvi svetlobi smo celice inkubirali v CO2 inkubatorju pri 37 °C 45 minut.Celice smo nato dvakrat sprali s Hanksovim HEPES pufrom in kontrastno obarvali s Hoechstom v Hanksovem HEPES pufru 10 minut pri sobni temperaturi in vizualizirali z uporabo konfokalnega mikroskopa ZEISS LSM 900., #M36008) v pufru HBSS, ki vsebuje kalcij in magnezij.Po izpostavitvi svetlobi ali doksorubicinu (MCE, #HY-15142A) smo celice inkubirali v CO2 inkubatorju pri 37 °C 10 minut, dvakrat sprali s HBSS pufrom in inkubirali s Hoechstom v HBSS pufru pri sobni temperaturi.minut.Doksorubicin je bil uporabljen kot pozitivna kontrola sonde, kjer so bile celice 30 minut obdelane z 20 μM doksorubicina v HBSS, ki je vseboval 1% BSA.Imunofluorescenčne slike so bile pridobljene z uporabo konfokalnega mikroskopa Zeiss LSM 900.
Celice HEK293T, ki stabilno izražajo mito-miniSOG, so bile zasejane pri gostoti približno 30 % v 15 cm posodah.Po 48 urah, ko je bila dosežena ~80-odstotna konfluentnost, so bile celice enkrat sprane s PBS, inkubirane z 1 mM sonde 3 v svežem pufru HBSS 1 uro pri 37 °C in nato osvetljene z modro LED 10 minut pri sobni temperaturo..Nato celice dvakrat speremo s PBS, postrgamo in resuspendiramo v ledeno mrzlem PBS pufru, ki vsebuje inhibitorje proteaze brez EDTA (MCE, #HY-K0011).Celice so bile lizirane z ultrazvočno sonikacijo konice 1 minuto (1 sekunda vklopljena in 1 sekunda izklopljena pri 35 % amplitudi).Nastalo zmes smo centrifugirali pri 15,871 xg 10 minut pri 4 °C, da smo odstranili ostanke, in koncentracijo supernatanta prilagodili na 4 mg/mL z uporabo kompleta za analizo beljakovin BCA (Beyotime, #P0009).Zmešajte 1 ml zgornjega lizata z 0,1 mM fotorazgradljivega biotin azida (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM liganda TBTA (Aladdin, #T162437) in 1 mM CuSO4 inkubatorja z dnom. vrtite 1 uro pri sobni temperaturi.Po hitri reakciji dodajte zmes v predhodno zmešano raztopino (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) v 10 ml stekleni viali.Vzorce smo premešali in centrifugirali pri 4500 g 10 minut pri sobni temperaturi.Spodnjo in zgornjo raztopino smo zavrgli, oborino dvakrat sprali z 1 ml metanola in centrifugirali pri 15871 × g 5 minut pri 4 °C.Dodajte 1 ml 8 M sečnine (Aladdin, št. U111902) v 25 mM amonijevega bikarbonata (ABC, Aladdin, št. A110539), da raztopite oborino.Vzorce smo rekonstituirali z 10 mM ditiotreitola (Sangon, #A100281 v 25 mM ABC) 40 minut pri 55 °C, čemur je sledil dodatek 15 mM svežega jodoacetamida (Sangon, #A600539) pri sobni temperaturi v temi.Alkilacija v 30 minutah..Dodali smo dodatnih 5 mM ditiotreitola, da smo zaustavili reakcijo.Pripravite približno 100 µl agaroznih kroglic NeutrAvidin (Thermo, #29202) za vsak vzorec s 3-kratnim izpiranjem z 1 ml PBS.Zgornjo raztopino proteoma smo razredčili s 5 ml PBS in inkubirali s predhodno opranimi agaroznimi kroglicami NeutrAvidin 4 ure pri sobni temperaturi.Kroglice smo nato 3-krat sprali s 5 ml PBS, ki je vseboval 0,2 % SDS (Sangon, #A600485), 3-krat s 5 ml PBS, ki je vseboval 1M sečnino, in 3-krat s 5 ml ddH2O.Kroglice smo nato pobrali s centrifugiranjem in resuspendirali v 200 μl 25 mM ABC, ki je vseboval 1 M sečnino, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) in 20 ng/μl tripsina (Promega, #V5280).Tripsinizirajte čez noč pri 37 °C z vrtenjem.Reakcijo smo ustavili z dodajanjem mravljinčne kisline (Thermo, # A117-50), dokler pH ni dosegel 2-3.Kroglice smo 3-krat sprali z 1 ml PBS, ki je vseboval 0, 2% SDS, 3-krat z 1 ml PBS, ki je vseboval 1 M sečnino, in nato 3-krat z 1 ml destilirane vode.Modificirane peptide smo sprostili s svetlobno lizo (365 nm) 90 minut z uporabo 200 μl 70% MeOH.Po centrifugiranju smo zbrali supernatant.Kroglice smo nato enkrat sprali s 100 μl 70% MeOH in supernatante združili.Vzorce smo posušili v vakuumskem koncentratorju Speedvac in do analize shranili pri -20°C.
Za identifikacijo in kvantifikacijo peptidov, modificiranih s singletnim kisikom, smo vzorce ponovno raztopili v 0,1 % mravljinčni kislini in 1 μg peptidov analizirali z uporabo masnega spektrometra Orbitrap Fusion Lumos Tribrid, opremljenega z virom nano ESI od Tune in Xcalibur iz programske opreme prodajalca 4.3.Vzorci so bili ločeni na kapilarni koloni 75 µm × 15 cm s 3 µm materialom C18 (ReproSil-pur, #r13.b9.) in povezani s sistemom EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Peptidi smo ločili z linearno 95-minutno gradientno kromatografijo od 8 % topila B do 50 % topila B (A = 0,1 % mravljinčne kisline v vodi, B = 0,1 % mravljinčne kisline v 80 % acetonitrilu), nato pa linearno povečali na 98 % B min. v 6 min pri pretoku 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos zbira podatke izmenično med popolnim skeniranjem MS in skeniranjem MS2, odvisno od podatkov.Napetost razprševanja je bila nastavljena na 2,1 kV, temperatura kapilare za transport ionov pa je bila 320 °C.MS spektri (350–2000 m/z) so bili zbrani z ločljivostjo 120.000, AGC 4 × 105 in največjim vnosnim časom 150 ms.10 najpogostejših večkratno nabitih prekurzorjev v vsakem celotnem skeniranju je bilo fragmentiranih z uporabo HCD z normalizirano energijo trka 30 %, kvadrupolnim izolacijskim oknom 1,6 m/z in nastavitvijo ločljivosti 30.000.Tarča AGC za tandemsko masno spektrometrijo z uporabo 5×104 in največjim vhodnim časom 150 ms.Dinamična izjema je nastavljena na 30 sekund. Nedodeljeni ioni ali ioni z nabojem 1+ in >7+ so bili zavrnjeni za MS/MS. Nedodeljeni ioni ali ioni z nabojem 1+ in >7+ so bili zavrnjeni za MS/MS. Neoznačeni ioni ali ioni s polnilnikom 1+ in >7+ so bili odstopani od MS/MS. Nedodeljeni ioni ali ioni z nabojem 1+ in >7+ so bili zavrnjeni za MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Neukazani ioni ali ioni z naboji 1+ in >7+ so bili odstopani od MS/MS. Nespecificirani ioni ali ioni z nabojem 1+ in >7+ so bili zavrnjeni za MS/MS.
Neobdelani podatki se obdelujejo z računalniško platformo FragPipe, ki temelji na MSFraggerju.Masne odstopanja in ustrezne aminokisline so bile določene z algoritmom odprtega iskanja s toleranco mase prekurzorja od -150 do 500 Da.Modificirane peptide smo nato identificirali z uporabo histidinskih modifikacij z masnimi pridobitvami +229,0964 in +247,1069 Da v PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Celice, ki stabilno izražajo spojeni gen miniSOG, so bile posejane v 6 cm velike posode.Ko smo dosegli ~80% sotočje, smo celice enkrat sprali s HBSS (Gibco, #14025092), nato inkubirali s kemičnimi sondami v HBSS 1 uro pri 37 °C in osvetlili z modro svetlobo.10 W LED 20 minut pri sobni temperaturi.Da bi ugotovili, katera vrsta reaktivnih kisikovih vrst je vključena v PDPL, 0,5 mM vitamina C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , 100 mM manitola (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 smo dodali celicam kot dodatke.Po izpiranju s hladnim PBS so bile celice postrgane, zbrane v 1, 5 ml centrifugirnih epruvetah in sonicirane s konico 1 minuto v 200 μl PBS z 1x zaviralcem proteaze brez EDTA (1 s in 1 s brez, amplituda 35%).Nastalo zmes smo centrifugirali pri 15,871 × g 10 minut pri 4 °C in koncentracijo supernatanta prilagodili na 1 mg/mL z uporabo kompleta za testiranje beljakovin BCA.Približno 50 µl zgornjega lizata smo inkubirali z 0,1 mM rodamin azida (Aladdin, št. T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA liganda in 1 mM CuSO4 1 uro pri sobni temperaturi z vrtenjem od spodaj navzgor.Po reakciji klika smo izvedli obarjanje z acetonom z dodajanjem 250 μl predhodno ohlajenega acetona vzorcem, inkubacijo pri -20 °C 20 minut in centrifugiranje pri 6010 × g 10 minut pri 4 °C.Zberite pelet in kuhajte v 50 µl 1x Laemmlijevega pufra 10 minut pri 95 °C.Vzorci so bili nato analizirani na dolgih gelih SDS-PAGE in vizualizirani z uporabo slikovnega sistema Bio-rad ChemiDoc MP Touch s programsko opremo Image Lab Touch.
Ekspresija in čiščenje rekombinantnega proteina miniSOG-6xHis je bila izvedena, kot je opisano prej.Na kratko, celice E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) smo transformirali s pET21a-miniSOG-6xHis in ekspresijo proteina inducirali z 0,5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Po celični lizi smo proteine ​​očistili z Ni-NTA agaroznimi kroglicami (MCE, št. 70666), dializirali proti PBS in shranili pri –80 °C.
Za in vitro test bližine oznake na osnovi protiteles zmešajte 100 μM prečiščenega miniSOG, 1 mM sonde 3 in 1 μg anti-označenega mišjega monoklonskega protitelesa (TransGen, #HT501-01) v PBS do skupne reakcijske prostornine 50 μl..Reakcijsko mešanico obsevamo z modro LED svetlobo 0, 2, 5, 10 in 20 minut pri sobni temperaturi.Zmes smo inkubirali z 0,1 mM biotin-PEG3-azidom (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA ligandom in 1 mM CuSO4 1 uro pri sobni temperaturi na stresalniku z gibanjem navzgor.Po hitri reakciji dodajte 4x Laemmlijev pufer neposredno v mešanico in pustite vreti pri 95 °C 10 minut.Vzorce smo analizirali na SDS-PAGE gelih in analizirali z western blotom s streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Sintetični peptid, ki vsebuje histidin, z amidacijo C-terminala (LHDALDAK-CONH2) je bil uporabljen za analizo in vitro označevanja na osnovi bližnjega peptida.V tem testu smo 100 μM očiščenega miniSOG, 10 mM sonde 3 in 2 μg/ml sintetičnega peptida zmešali v PBS v skupni reakcijski prostornini 50 μl.Reakcijsko zmes smo obsevali z modro LED svetlobo 1 uro pri sobni temperaturi.En mikroliter vzorca je bil analiziran s sistemom LC-MS (Waters, masni spektrometer SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight s programsko opremo za analizo spektra MassLynx).
Celice HEK293T, ki stabilno izražajo fuzijski gen miniSOG, so bile posejane v 10 cm velike posode za linije z različno lokalizacijo organelov (Mito, ER, Nucleus) in 15 cm velike posode za linije Parkin-miniSOG in BRD4-miniSOG.Ko smo dosegli ~90% sotočje, smo celice enkrat sprali s HBSS, nato inkubirali s sondo 3 v HBSS 1 uro pri 37 °C in osvetlili z 10 W modro LED pri sobni temperaturi.Za brezkontaktno označevanje Parkina smo dodali 10 µM proton karbonil cianidnega nosilca m-klorofenilhidrazona CCCP (Solarbio, #C6700) s sondo 3 v HBSS za 1 uro pri 37 °C.Koraki celične lize, kemije klika, redukcije in alkiliranja so bili enaki, kot je opisano zgoraj, le da smo dodali 2 mg lizata in v reakciji klika uporabili biotin PEG3 azid namesto fotorazgradljivega biotin azida.Po obogatitvi smo kroglice 3-krat sprali s 5 ml PBS, ki je vseboval 0, 2% SDS, 3-krat s 5 ml PBS, ki je vseboval 1 M sečnino, in 3-krat s 5 ml PBS.Nato dodamo 2 µg tripsina k 300 µl 25 mM ABC, ki vsebuje 1 M sečnino, da cepimo protein čez noč pri 37 °C.Reakcijo smo ustavili z dodajanjem mravljinčne kisline, dokler ni bil dosežen pH 2-3.Po tripsinizaciji na kroglicah smo raztopino peptida razsolili z uporabo kolone SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) in posušili v vakuumskem koncentratorju Speedvac.Peptide smo ponovno raztopili v 0,1 % mravljinčni kislini in 500 ng peptidov analizirali z uporabo masnega spektrometra Orbitrap Fusion Lumos Tribrid, opremljenega z zgoraj opisanim virom nano-ESI.Peptide smo ločili na komercialnih predkolonah RP-HPLC (75 μm x 2 cm) (Thermo, št. 164946) in analitskih kolonah RP-HPLC (75 μm x 25 cm) (Thermo, št. 164941), obe napolnjeni z 2 μm.gradient z 8 % na 35 % ACN v 60 minutah, nato linearno povečan na 98 % B v 6 minutah pri pretoku 300 Nl/min.MS spektri (350-1500 m/z) so bili zbrani z ločljivostjo 60.000, AGC 4 × 105 in največjim vnosnim časom 50 ms.Izbrane ione je zaporedno fragmentiral HCD v ciklih 3 s z normalizirano energijo trka 30 %, kvadrupolnim izolacijskim oknom 1,6 m/z in ločljivostjo 15000. Tarča AGC tandemskega masnega spektrometra 5 × 104 in največji čas vbrizgavanja uporabljenih 22 ms.Dinamična izključitev je nastavljena na 45 sekund. Nedodeljeni ioni ali ioni z nabojem 1+ in >7+ so bili zavrnjeni za MS/MS. Nedodeljeni ioni ali ioni z nabojem 1+ in >7+ so bili zavrnjeni za MS/MS. Neoznačeni ioni ali ioni s polnilnikom 1+ in >7+ so bili odstopani od MS/MS. Nedodeljeni ioni ali ioni z nabojem 1+ in >7+ so bili zavrnjeni za MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Neukazani ioni ali ioni z naboji 1+ in >7+ so bili odstopani od MS/MS. Nespecificirani ioni ali ioni z nabojem 1+ in >7+ so bili zavrnjeni za MS/MS.
Koraki priprave vzorca do obogatitve kroglic NeutrAvidina so bili enaki kot pri zgoraj opisani analizi LC-MS/MS.Približno 50 μg lizata smo uporabili kot vnos za nadzor obremenitve in 2 mg lizata smo uporabili za reakcije klika.Po obogatitvi in ​​izpiranju z nevtravidinom smo vezane proteine ​​eluirali z dodajanjem 50 μl Laemmlijevega pufra kroglicam agarozne smole in vreli pri 95 °C 5 minut.Vnos kontrolne obremenitve in vzorce, obogatene s kroglicami, smo analizirali s SDS-PAGE in jih prenesli na PVDF membrane (Millipore, #ISEQ00010) s standardnimi metodami Western blot.Membrane so bile blokirane s 5 % posnetim mlekom (Sangon, #A600669) v TBS, ki je vseboval 0,1 % tween-20 (TBST), in zaporedno inkubirane s primarnimi in sekundarnimi protitelesi.Primarna protitelesa smo razredčili 1:1000 v 5 % posnetem mleku v TBST in inkubirali čez noč pri 4 °C.Sekundarna protitelesa smo uporabili v razmerju 1:5000 in jih inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi.Membrane smo vizualizirali s kemiluminiscenco z uporabo sistema za slikanje Chemidoc MP.Vsi neobrezani skeni madežev in gelov na sliki so predstavljeni kot neobdelani podatki.
Primarna protitelesa, uporabljena v tej študiji, so vključevala kunčje monoklonsko protitelo anti-SFPQ (CST, št. 71992), kunčje monoklonsko protitelo anti-FUS (CST, št. 67840), kunčje poliklonsko protitelo anti-NSUN2 (Proteintech, št. 20854-1- AP), kunčje poliklonsko protitelo proti mSin3A (Abcam, #ab3479), mišje monoklonsko protitelo proti oznaki (TransGen, #HT201-02), mišje monoklonsko protitelo proti β-aktinu (TransGen, #HC201-01), kunčje protitelo -CDK2 monoklonsko protitelo (ABclonal, #A0094), kunčje monoklonsko protitelo proti CTBP1 (ABclonal, #A11600), kunčje poliklonsko protitelo proti DUT (ABclonal, #A2901), kunčje poliklonsko protitelo proti PSMC4 (ABclonal, #A2505), zajčje anti- Poliklonsko protitelo DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Ta protitelesa so bila uporabljena v razredčitvi 1:1000 v 5 % posnetem mleku v TBST.Sekundarna protitelesa, uporabljena v tej študiji, so vključevala anti-kunčji IgG (TransGen, #HS101-01), protimišji IgG (TransGen, #HS201-01) v razredčitvi 1:5000.
Za nadaljnjo preiskavo, ali BRD4 medsebojno deluje s SFPQ, so bile stabilne celice HEK293T in BRD4-miniSOG, ki prekomerno izražajo HEK293T, posejane v 10 cm velike posode.Celice smo sprali s hladnim PBS in lizirali v 1 ml Pierce IP liznega pufra (Thermo Fisher, #87787) z inhibitorjem proteaze brez EDTA 30 minut pri 4 °C.Po tem smo lizate zbrali v 1,5 ml centrifugalne epruvete in centrifugirali pri 15,871 xg 10 minut pri 4 °C.Supernatant smo pobrali in inkubirali s 5 µg anti-V5 označenega mišjega monoklonskega protitelesa (CST, #80076) čez noč pri 4 °C.Dvakrat sperite približno 50 µl magnetnih kroglic proteina A/G (MCE, #HY-K0202) s PBS, ki vsebuje 0,5 % Tween-20.Nato smo celične lizate inkubirali z magnetnimi kroglicami 4 ure pri 4 °C z vrtenjem od spodaj navzgor.Nato smo kroglice štirikrat sprali z 1 ml PBST pufra in kuhali pri 95 ° C 5 minut.Vzorci so bili analizirani na SDS-PAGE gelih in preneseni na PVDF membrane z uporabo standardnih Western blot metod.Membrane so bile blokirane v 5 % posnetem mleku v TBST in zaporedno inkubirane s primarnimi in sekundarnimi protitelesi.Primarno protitelo Zajčje monoklonsko protitelo proti SFPQ (CST, #71992) smo uporabili v razmerju 1:1000 v 5 % posnetem mleku v TBST in inkubirali čez noč pri 4 °C.Anti-kunčji IgG smo uporabili v razmerju 1:5000 in inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi.Membrane smo vizualizirali s kemiluminiscenco z uporabo sistema za slikanje Chemidoc MP.
Vse strukture, uporabljene za analizo SASA (Solvent Accessible Surface Area), so bile pridobljene iz Protein Data Bank (PDB)52 ali AlphaFold Protein Structure Database53.Absolutni SASA je bil izračunan za vsak ostanek s programom FreeSASA.Za pridobitev srednje vrednosti SASA za vsako strukturo so bili uporabljeni samo popolni in nedvoumni podatki SASA za označeni histidin in njegove sosede.Relativno dostopnost topila (RSA) za vsak histidin smo izračunali tako, da smo absolutno vrednost SASA delili z empirično največjo možno površino ostanka, ki je na voljo topilu.Vsi histidini so bili nato razvrščeni kot skriti, če je bila povprečna RSA pod 20 %, sicer izpostavljeni56.
Neobdelane datoteke, pridobljene v načinu DDA, so bile preiskane z uporabo Proteome Discoverer (v2.5) ali MSfragger (Fragpipe v15.0) v ustrezni podatkovni zbirki proteinov, preverjeni SwissProt, ki vsebuje običajne onesnaževalce.Peptidi so zahtevali popoln tripsin z dvema manjkajočima mestoma cepitve, metilacijo karbamoila kot fiksno modifikacijo in oksidacijo metionina kot dinamično modifikacijo.Tolerance teže prekurzorja in fragmentov so bile nastavljene na 10 ppm oziroma 0,02 Da (MS2 Orbitrap). Zadetke kontaminantov smo odstranili in proteine ​​filtrirali, da smo dobili stopnjo lažnega odkritja <1 %. Zadetke kontaminantov smo odstranili in proteine ​​filtrirali, da smo dobili stopnjo lažnega odkritja <1 %. Popadanje zagrenjenih snovi je bilo odstranjeno, a bele odfiltrirane, da bi dobili koeficient napačnega odkritja <1%. Zadetki kontaminantov so bili odstranjeni in proteini filtrirani, da je bila stopnja napačne detekcije <1 %.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1 %的错误发现率。 <1% 的错误发现率. Popadki onesnaženih snovi so bili odstranjeni, bele barve pa so bile odfiltrirane za doseganje stopnje lažnih odkritij <1%. Zadetke kontaminantov smo odstranili in proteine ​​filtrirali, da smo dosegli lažno pozitivno stopnjo <1 %.Za kvantitativno analizo brez uporabe oznak smo uporabili normalizirano vsebnost beljakovin iz treh bioloških ponovitev.Analiza podcelične lokalizacije beljakovin je bila izvedena z analizo genske ontologije (GO) iz DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 in baz podatkov, ki jih je zbrala in objavila skupina Alice Ting.Zemljevid vulkana je bil pridobljen iz Perzeja (v1.6.15.0). Gubne spremembe številčnosti beljakovin so bile testirane glede statistične pomembnosti z dvostranskim t-testom, zadetki beljakovin pa so bili identificirani s spremembo številčnosti >2 (če ni drugače navedeno) in vrednostjo p <0,05. Gubne spremembe številčnosti beljakovin so bile testirane glede statistične pomembnosti z dvostranskim t-testom, zadetki beljakovin pa so bili identificirani s spremembo številčnosti >2 (če ni drugače navedeno) in vrednostjo p <0,05. Spremembe kratnosti vsebine bele so bile potrjene na statistično pomembnost z uporabo dvostranskega t-kriterija, in sorodni belki so bili identificirani s spremembo vsebnosti > 2 (če ni navedeno inoe) in vrednostjo p <0,05. Večkratne spremembe vsebnosti beljakovin so bile preizkušene glede statistične pomembnosti z dvostranskim t-testom in ujemanja beljakovin so bila identificirana s spremembo vsebnosti >2 (če ni drugače navedeno) in vrednostjo ap <0,05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍数 变化 的 的 统计 显着性 ， 并 蛋白质 蛋白质 命 中 的 的 丰度> 2 （除非 另 有 说明 说明 说明）））） 说明 说明 值 值 <0,05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 数 变化 的 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 中 的 丰度> 2 （另 有 说明 说明）））） 和 和 P 值 <0,05。 Statistična pomembnost kratkotrajnih sprememb vsebine beleke je bila preverjena z uporabo dvostranskega t-kriterija, a sosednje bele barve so bile določene za spremembe vsebine > 2 (če ni navedeno inno) in p-značen <0,05. Statistično pomembnost kratnih sprememb v vsebnosti beljakovin je bila testirana z dvostranskim t-testom in ujemanje beljakovin je bilo določeno za spremembe vsebnosti >2 (če ni drugače navedeno) in p-vrednosti <0,05.Analiza interakcij proteinov je bila izvedena z analizo GO skupaj z bazo podatkov String.
Izvedene so bile tri biološke ponovitve s podobnimi rezultati.Statistična analiza je bila narejena s programom GraphPad Prism (programska oprema GraphPad), grafikoni vulkanov pa so bili ustvarjeni s programom Perseus (v1.6.15.0).Za primerjavo obeh skupin so bile p-vrednosti določene z dvostranskim Studentovim t-testom.V vulkanske ploskve so bili vključeni samo enojni proteini, identificirani vsaj dvakrat v eksperimentalni skupini, ustrezne manjkajoče vrednosti v kontrolni skupini pa so bile nadomeščene s Perseusom iz normalne porazdelitve, tako da je bilo mogoče izračunati p-vrednost.Vrstice napak predstavljajo povprečje ± standardni odklon.V proteomskih analizah za statistično analizo je bila ohranjena številčnost beljakovin, ki so se pojavile v vsaj dveh bioloških ponovitvah.Za vnaprejšnjo določitev velikosti vzorca niso bile uporabljene statistične metode.Eksperimenti niso naključni.Raziskovalci niso bili slepi za naloge med eksperimentom in vrednotenjem rezultatov.
Za več informacij o zasnovi študije glejte povzetek Nature Research Report, ki je povezan s tem člankom.
Podatki masne spektrometrije, pridobljeni v tej študiji, so bili predloženi konzorciju ProteomeXchange prek partnerskega repozitorija iProX57 pod ID nabora podatkov PXD034811 (nabor podatkov PDPL-MS).Neobdelani podatki so na voljo v obliki neobdelanih podatkovnih datotek.Ta članek vsebuje izvirne podatke.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Spoznavanje soseske: uporaba od bližine odvisne biotinilacije za karakterizacijo proteinskih kompleksov in kartiranje organelov. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Spoznavanje soseske: uporaba od bližine odvisne biotinilacije za karakterizacijo proteinskih kompleksov in kartiranje organelov.Gingras, AS, Abe, KT in Raut, B. Poznavanje okolice: uporaba od bližine odvisne biotinilacije za karakterizacijo proteinskih kompleksov in kartiranje organelov. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物并绘制细胞器图。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Razumevanje soseske: uporabite odvisnost soseske od biološkega življenja.Gingras, AS, Abe, KT in Raut, B. Razumevanje bližine: karakterizacija proteinskih kompleksov in kartiranje organelov z uporabo biotinilacije, odvisne od bližine.Trenutno.Moje mnenje.Kemični.biologija 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Kartiranje mikrookolja s prenosom energije Dexter v imunske celice.Znanost 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Mreže z dvema proteomoma zaznavajo celično specifično preoblikovanje človeškega interaktoma.Celice 184, 3022–3040.e3028 (2021).