Novice

Hvala, ker ste obiskali Nature.com.Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS.Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju).Medtem bomo za zagotovitev stalne podpore spletno mesto upodobili brez slogov in JavaScripta.
Učinkoviti fotosenzibilizatorji so še posebej pomembni za široko klinično uporabo fototerapije.Vendar pa običajni fotosenzibilizatorji na splošno trpijo zaradi absorpcije kratkih valovnih dolžin, nezadostne fotostabilnosti, nizkega kvantnega izkoristka reaktivnih kisikovih vrst (ROS) in gašenja ROS, ki ga povzroči agregacija.Tukaj poročamo o skoraj infrardečem (NIR) supramolekularnem fotosenzibilizatorju (RuDA), posredovanem s samosestavljanjem organokovinskih kompleksov Ru(II)-arena v vodni raztopini.RuDA lahko proizvede samo singletni kisik (1O2) v agregatnem stanju in kaže očitno vedenje pri ustvarjanju 1O2, ki ga povzroči agregacija, zaradi znatnega povečanja križnega procesa med singlet-tripletnim sistemom.Pod delovanjem laserske svetlobe 808 nm ima RuDA kvantni izkoristek 1O2 16,4 % (s strani FDA odobreno indocianin zeleno: ΦΔ=0,2 %) in visoko učinkovitost fototermične pretvorbe 24,2 % (komercialne zlate nanopalice) z odlično fotostabilnostjo.: 21,0 %, zlate nanolupine: 13,0 %).Poleg tega se lahko RuDA-NP z dobro biokompatibilnostjo prednostno kopičijo na mestih tumorja, kar povzroči znatno regresijo tumorja med fotodinamično terapijo z 95,2-odstotnim zmanjšanjem volumna tumorja in vivo.Ta fotodinamična terapija za izboljšanje agregacije zagotavlja strategijo za razvoj fotosenzibilizatorjev z ugodnimi fotofizikalnimi in fotokemičnimi lastnostmi.
V primerjavi s konvencionalno terapijo je fotodinamična terapija (PDT) privlačno zdravljenje raka zaradi svojih pomembnih prednosti, kot so natančen prostorsko-časovni nadzor, neinvazivnost, zanemarljiva odpornost na zdravila in zmanjšanje stranskih učinkov 1,2,3.Pod svetlobnim obsevanjem se lahko uporabljeni fotosenzibilizatorji aktivirajo, da tvorijo visoko reaktivne kisikove spojine (ROS), kar vodi do apoptoze/nekroze ali imunskih odzivov 4,5. Vendar ima večina običajnih fotosenzibilizatorjev, kot so klorini, porfirini in antrakinoni, absorpcijo relativno kratke valovne dolžine (frekvenca < 680 nm), kar povzroči slabo prodiranje svetlobe zaradi intenzivne absorpcije bioloških molekul (npr. hemoglobina in melanina) v vidna regija6,7. Vendar ima večina običajnih fotosenzibilizatorjev, kot so klorini, porfirini in antrakinoni, absorpcijo relativno kratke valovne dolžine (frekvenca < 680 nm), kar povzroči slabo prodiranje svetlobe zaradi intenzivne absorpcije bioloških molekul (npr. hemoglobina in melanina) v vidna regija6,7. Vendar pa večina običajnih fotosenzibilizatorjev, kot so klorini, porfirini in antrahinoni, ima glede na kratkovoljno pogolenje (delovina < 680 nm), kar povzroči slabo prodiranje sveta zaradi močnega pogolenja bioloških molekul (na primer gemoglobina in melanina) v vidnem območju6,7. Vendar imajo najpogostejši fotosenzibilizatorji, kot so klorini, porfirini in antrakinoni, absorpcijo relativno kratke valovne dolžine (< 680 nm), kar povzroči slabo penetracijo svetlobe zaradi intenzivne absorpcije bioloških molekul (npr. hemoglobina in melanina) v vidno območje6,7.然而，大多数传统的光敏剂，如二氢卟酚、卟啉和蒽醌，具有相对较短的波长吸收（频率< 680 nm），因此由于对生物分子（如血红蛋白和黑色素）的强烈吸收，导致光穿透性差。然而 ， 大多数 传统 的 光敏剂 ， 二 氢 卟酚 、 卟啉 蒽醌 ， 具有 相对 较 短 的 波长 吸收 （频率 频率 <680 nm） 因此 由于 对 分子 （血红 蛋白 和 黑色素） 的 ， ， ， ， 吸收 吸收吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI导致光穿透性差。 Vendar ima večina tradicionalnih fotosenzibilizatorjev, kot so klorini, porfirini in antrahinoni, relativno kratkovoljno poglobljenost (delovina < 680 nm) zaradi močne pogloščenosti biomolekul, kot sta gemoglobin in melanin, ki povzroča slabo prodiranje sveta. Vendar pa ima večina tradicionalnih fotosenzibilizatorjev, kot so klorini, porfirini in antrakinoni, absorpcijo relativno kratke valovne dolžine (frekvenca < 680 nm) zaradi močne absorpcije biomolekul, kot sta hemoglobin in melanin, kar povzroči slabo penetracijo svetlobe.Vidno območje 6.7.Zato so fotosenzibilizatorji, ki absorbirajo bližnje infrardeče (NIR), ki se aktivirajo v "terapevtskem oknu" 700–900 nm, zelo primerni za fototerapijo.Ker bližnjo infrardečo svetlobo najmanj absorbirajo biološka tkiva, lahko vodi do globljega prodiranja in manjše fotopoškodbe8,9.
Na žalost imajo obstoječi fotosenzibilizatorji, ki absorbirajo NIR, na splošno slabo fotostabilnost, nizko sposobnost generiranja singletnega kisika (1O2) in dušenje 1O2, ki ga povzroča agregacija, kar omejuje njihovo klinično uporabo10,11.Čeprav so bila vložena velika prizadevanja za izboljšanje fotofizikalnih in fotokemičnih lastnosti običajnih fotosenzibilizatorjev, je doslej več poročil poročalo, da lahko fotosenzibilizatorji, ki absorbirajo NIR, rešijo vse te težave.Poleg tega je več fotosenzibilizatorjev pokazalo obljubo za učinkovito ustvarjanje 1O212, 13, 14 pri obsevanju s svetlobo nad 800 nm, saj se energija fotona hitro zmanjša v območju blizu IR.Trifenilamin (TFA) kot darovalec elektronov in [1,2,5]tiadiazol-[3,4-i]dipirido[a,c]fenazin (TDP) kot skupina akceptorjev elektronov Razred barvil tipa donor-akceptor (DA) barvil, ki absorbirajo bližnjo infrardečo svetlobo, ki so bila obsežno raziskana za bližnje infrardeče bioslik II in fototermalno terapijo (PTT) zaradi njihove ozke pasovne vrzeli.Barvila tipa DA se torej lahko uporabljajo za PDT z vzbujanjem blizu IR, čeprav so jih le redko preučevali kot fotosenzibilizatorje za PDT.
Dobro je znano, da visoka učinkovitost medsistemskega prehoda (ISC) fotosenzibilizatorjev spodbuja nastanek 1O2.Običajna strategija za napredovanje procesa ISC je izboljšanje sklopitve spin-orbita (SOC) fotosenzibilizatorjev z uvedbo težkih atomov ali posebnih organskih delov.Vendar ima ta pristop še vedno nekaj slabosti in omejitev19,20.Pred kratkim je supramolekularno samosestavljanje zagotovilo inteligenten pristop od spodaj navzgor za izdelavo funkcionalnih materialov na molekularni ravni, 21, 22 s številnimi prednostmi v fototerapiji: (1) samosestavljeni fotosenzibilizatorji imajo lahko potencial za oblikovanje trakastih struktur.Podobno kot elektronske strukture z gostejšo porazdelitvijo energijskih nivojev zaradi prekrivanja orbit med gradniki.Zato se bo energijsko ujemanje med spodnjim singletno vzbujenim stanjem (S1) in sosednjim tripletnim vzbujenim stanjem (Tn) izboljšalo, kar je koristno za proces ISC 23, 24.(2) Supramolekularna sestava bo zmanjšala nesevalno relaksacijo na podlagi mehanizma za omejevanje intramolekularnega gibanja (RIM), ki prav tako spodbuja proces ISC 25, 26.(3) Supramolekularni sklop lahko zaščiti notranje molekule monomera pred oksidacijo in razgradnjo, s čimer močno izboljša fotostabilnost fotosenzibilizatorja.Glede na zgornje prednosti verjamemo, da so lahko supramolekularni fotosenzibilizacijski sistemi obetavna alternativa za premagovanje pomanjkljivosti PDT.
Kompleksi, ki temeljijo na Ru(II), so obetavna medicinska platforma za potencialno uporabo pri diagnostiki in terapiji bolezni zaradi svojih edinstvenih in privlačnih bioloških lastnosti28,29,30,31,32,33,34.Poleg tega številčnost vzbujenih stanj in nastavljive fotofizikalno-kemijske lastnosti kompleksov na osnovi Ru(II) zagotavljajo velike prednosti za razvoj fotosenzibilizatorjev na osnovi Ru(II)35,36,37,38,39,40.Pomemben primer je rutenijev (II) polipiridilni kompleks TLD-1433, ki je trenutno v fazi II kliničnih preskušanj kot fotosenzibilizator za zdravljenje nemišično invazivnega raka mehurja (NMIBC)41.Poleg tega se organometalni kompleksi rutenij (II) arena pogosto uporabljajo kot kemoterapevtska sredstva za zdravljenje raka zaradi njihove nizke toksičnosti in enostavne modifikacije 42, 43, 44, 45.Ionske lastnosti organokovinskih kompleksov Ru(II)-arena ne morejo samo izboljšati slabe topnosti kromoforjev DA v običajnih topilih, temveč tudi izboljšati sestavljanje kromoforjev DA.Poleg tega lahko psevdooktaedrična polovična sendvič struktura organokovinskih kompleksov Ru(II)-arenov sterično prepreči H-agregacijo kromoforjev tipa DA in s tem olajša nastanek J-agregacije z rdeče premaknjenimi absorpcijskimi pasovi.Vendar pa lahko inherentne pomanjkljivosti kompleksov Ru(II)-aren, kot sta nizka stabilnost in/ali slaba biološka uporabnost, vplivajo na terapevtsko učinkovitost in in vivo aktivnost kompleksov aren-Ru(II).Vendar so študije pokazale, da je te pomanjkljivosti mogoče premagati z inkapsulacijo rutenijevih kompleksov z biokompatibilnimi polimeri s fizično inkapsulacijo ali kovalentno konjugacijo.
V tem delu poročamo o DA-konjugiranih kompleksih Ru(II)-arena (RuDA) s sprožilcem NIR prek koordinacijske vezi med kromoforjem DAD in Ru(II)-arenskim delom.Nastali kompleksi se lahko zaradi nekovalentnih interakcij sami sestavijo v metalosupramolekularne vezikle v vodi.Predvsem je supramolekularni sklop RuDA obdaril z lastnostmi medsistemskega prehoda, ki jih povzroči polimerizacija, kar je znatno povečalo učinkovitost ISC, kar je bilo zelo ugodno za PDT (slika 1A).Za povečanje kopičenja tumorja in biokompatibilnosti in vivo je bil uporabljen Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO), ki ga je odobrila FDA, za inkapsulacijo RuDA47,48,49 za ustvarjanje nanodelcev RuDA-NP (slika 1B), ki so delovali kot zelo učinkovit PDT/Dual- način PTT proxy.Pri fototerapiji raka (slika 1C) je bil RuDA-NP uporabljen za zdravljenje golih miši s tumorji MDA-MB-231 za preučevanje učinkovitosti PDT in PTT in vivo.
Shematski prikaz fotofizičnega mehanizma RuDA v monomernih in agregiranih oblikah za fototerapijo raka, sinteza B RuDA-NP in C RuDA-NP za NIR-aktiviran PDT in PTT.
RuDA, sestavljen iz funkcionalnosti TPA in TDP, je bil pripravljen v skladu s postopkom, prikazanim na dodatni sliki 1 (slika 2A), RuDA pa je bil karakteriziran z 1H in 13C NMR spektri, ionizacijsko masno spektrometrijo z elektrosprejem in elementarno analizo (dodatne slike 2-4). ).Zemljevid razlike elektronske gostote RuDA najnižjega singletnega prehoda je bil izračunan s časovno odvisno funkcionalno teorijo gostote (TD-DFT) za preučevanje procesa prenosa naboja.Kot je prikazano na dodatni sliki 5, se elektronska gostota premika predvsem od trifenilamina do akceptorske enote TDP po fotoekscitaciji, kar je mogoče pripisati tipičnemu intramolekularnemu prehodu prenosa naboja (CT).
Kemijska struktura rude. B Absorpcijski spektri rude v mešanicah različnih razmerij DMF in vode.C Normalizirane vrednosti absorpcije RuDA (800 nm) in ICG (779 nm) glede na čas pri 0,5 W cm-2 laserske svetlobe 808 nm.D Na fotorazgradnjo ABDA kaže RuDA inducirana tvorba 1O2 v mešanicah DMF/H2O z različno vsebnostjo vode pod delovanjem laserskega sevanja z valovno dolžino 808 nm in močjo 0,5 W/cm2.
Povzetek – UV-vidna absorpcijska spektroskopija je bila uporabljena za preučevanje lastnosti samosestavljanja rude v mešanicah DMF in vode v različnih razmerjih.Kot je prikazano na sl.2B kaže RuDA absorpcijske pasove od 600 do 900 nm v DMF z največjim absorpcijskim pasom pri 729 nm.Povečanje količine vode je povzročilo postopni rdeči premik maksimuma absorpcije rude na 800 nm, kar kaže na J-agregacijo rude v sestavljenem sistemu.Spektri fotoluminiscence RuDA v različnih topilih so prikazani na dodatni sliki 6. Zdi se, da RuDA kaže tipično luminiscenco NIR-II z največjo valovno dolžino emisije ca.1050 nm v CH2Cl2 oziroma CH3OH.Velik Stokesov premik (približno 300 nm) RuDA kaže na pomembno spremembo v geometriji vzbujenega stanja in nastanek nizkoenergijskih vzbujenih stanj.Ugotovljeno je bilo, da je kvantni izkoristek luminescence rude v CH2Cl2 in CH3OH 3,3 oziroma 0,6 %.Vendar pa so v mešanici metanola in vode (5/95, v/v) opazili rahel rdeči premik emisije in zmanjšanje kvantnega izkoristka (0,22 %), kar je lahko posledica samosestavljanja rude .
Za vizualizacijo samosestavljanja ORE smo uporabili mikroskopijo s tekočo atomsko silo (AFM) za vizualizacijo morfoloških sprememb v ORE v raztopini metanola po dodajanju vode.Ko je bila vsebnost vode pod 80 %, ni bilo opaziti jasnega združevanja (dodatna slika 7).Vendar pa so se z nadaljnjim povečanjem vsebnosti vode na 90–95 % pojavili majhni nanodelci, ki so kazali na samosestavljanje rude. Poleg tega lasersko obsevanje z valovno dolžino 808 nm ni vplivalo na intenzivnost absorpcije RuDA v vodnem rešitev (slika 2C in dopolnilna slika 8).V nasprotju s tem je absorbanca indocianin zelenega (ICG kot kontrola) hitro padla pri 779 nm, kar kaže na odlično fotostabilnost RuDA.Poleg tega je bila stabilnost RuDA-NP v PBS (pH = 5,4, 7,4 in 9,0), 10 % FBS in DMEM (visoka glukoza) pregledana z UV-vidno absorpcijsko spektroskopijo v različnih časovnih točkah.Kot je prikazano na dodatni sliki 9, so opazili rahle spremembe v absorpcijskih pasovih RuDA-NP v PBS pri pH 7,4/9,0, FBS in DMEM, kar kaže na odlično stabilnost RuDA-NP.V kislem mediju (рН = 5,4) pa je bila ugotovljena hidroliza rude.Prav tako smo dodatno ovrednotili stabilnost RuDA in RuDA-NP z metodami tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC).Kot je prikazano na dodatni sliki 10, je bil RuDA prvo uro stabilen v mešanici metanola in vode (50/50, v/v), hidrolizo pa so opazili po 4 urah.Vendar pa je bil za RuDA NP opažen le širok konkavno-konveksni vrh.Zato je bila za oceno stabilnosti RuDA NP v PBS (pH = 7,4) uporabljena gelska permeacijska kromatografija (GPC).Kot je prikazano na dodatni sliki 11, se po 8 urah inkubacije pod testiranimi pogoji višina vrha, širina vrha in površina vrha NP RuDA niso bistveno spremenile, kar kaže na odlično stabilnost NP RuDA.Poleg tega so slike TEM pokazale, da je morfologija nanodelcev RuDA-NP ostala skoraj nespremenjena po 24 urah v razredčenem PBS pufru (pH = 7,4, dopolnilna slika 12).
Ker lahko samosestavljanje daje rudi različne funkcionalne in kemijske lastnosti, smo opazili sproščanje 9,10-antracendiilbis(metilen)dimalonske kisline (ABDA, indikator 1O2) v mešanicah metanola in vode.Ruda z različno vsebnostjo vode50.Kot je prikazano na sliki 2D in dodatni sliki 13, ni bilo opaziti razgradnje ABDA, ko je bila vsebnost vode pod 20 %.S povečanjem vlažnosti na 40 % je prišlo do razgradnje ABDA, kar dokazuje zmanjšanje intenzivnosti fluorescence ABDA.Ugotovljeno je bilo tudi, da višja vsebnost vode povzroči hitrejšo razgradnjo, kar kaže, da je samosestavljanje RuDA potrebno in koristno za razgradnjo ABDA.Ta pojav se zelo razlikuje od sodobnih kromoforjev ACQ (gašenje, povzročeno z agregacijo).Pri obsevanju z laserjem z valovno dolžino 808 nm je kvantni izkoristek 1O2 RuDA v mešanici 98 % H2O/2 % DMF 16,4 %, kar je 82-krat več kot pri ICG (ΦΔ = 0,2 %)51, dokazuje izjemno učinkovitost proizvodnje 1O2 RuDA v agregatnem stanju.
Elektronski vrti z uporabo 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidinona (TEMP) in 5,5-dimetil-1-pirolin N-oksida (DMPO) kot vrtilnih pasti. Za identifikacijo nastale vrste je bila uporabljena resonančna spektroskopija (ESR). AFK.avtor RuDA.Kot je prikazano na dodatni sliki 14, je bilo potrjeno, da 1O2 nastane pri časih obsevanja med 0 in 4 minutami.Poleg tega, ko je bil RuDA inkubiran z DMPO ob obsevanju, je bil zaznan tipičen štirivrstični EPR signal 1:2:2:1 DMPO-OH· adukta, kar kaže na tvorbo hidroksilnih radikalov (OH·).Na splošno zgornji rezultati kažejo sposobnost RuDA, da stimulira proizvodnjo ROS s postopkom fotosenzibilizacije dvojnega tipa I/II.
Za boljše razumevanje elektronskih lastnosti RuDA v monomernih in agregiranih oblikah so bile mejne molekularne orbitale RuDA v monomernih in dimernih oblikah izračunane z metodo DFT.Kot je prikazano na sl.Na sliki 3A je najvišja zasedena molekularna orbitala (HOMO) monomerne RuDA delokalizirana vzdolž hrbtenice liganda, najnižja nezasedena molekularna orbitala (LUMO) pa je osredotočena na sprejemno enoto TDP.Nasprotno, gostota elektronov v dimernem HOMO je koncentrirana na ligandu ene molekule RuDA, medtem ko je gostota elektronov v LUMO koncentrirana predvsem na akceptorski enoti druge molekule RuDA, kar kaže, da je RuDA v dimerju.Značilnosti CT.
A HOMO in LUMO rude sta izračunana v monomerni in dimerni obliki.B Singletne in tripletne energijske ravni rude v monomerih in dimerih.C Ocenjene ravni RuDA in možni kanali ISC kot monomerni C in dimerni D. Puščice označujejo možne kanale ISC.
Porazdelitev elektronov in lukenj v nizkoenergijskih singletno vzbujenih stanjih RuDA v monomerni in dimerni obliki smo analizirali s programsko opremo Multiwfn 3.852.53, ki smo jih izračunali z metodo TD-DFT.Kot je navedeno na dodatni etiketi.Kot je prikazano na slikah 1-2, so monomerne luknje RDA večinoma delokalizirane vzdolž hrbtenice liganda v teh singletno vzbujenih stanjih, medtem ko so elektroni večinoma locirani v skupini TDP, kar kaže na intramolekularne značilnosti CT.Poleg tega obstaja za ta singletno vzbujena stanja bolj ali manj prekrivanja med luknjami in elektroni, kar nakazuje, da ta singletno vzbujena stanja prispevajo nekaj lokalnega vzbujanja (LE).Pri dimerih so poleg intramolekularnih CT in LE značilnosti opazili določen delež medmolekularnih CT značilnosti v ustreznih stanjih, zlasti S3, S4, S7 in S8, na podlagi medmolekularne CT analize, pri čemer so glavni medmolekularni prehodi CT (dodatna tabela).3).
Da bi bolje razumeli eksperimentalne rezultate, smo nadalje raziskali lastnosti vzbujenih stanj RuDA, da bi raziskali razlike med monomeri in dimeri (dodatne tabele 4–5).Kot je prikazano na sliki 3B, so ravni energije singletnih in tripletnih vzbujenih stanj dimera veliko gostejše od ravni monomera, kar pomaga zmanjšati energijsko vrzel med S1 in Tn. Poročali so, da bi lahko prehode ISC realizirali v majhni energijski vrzeli (ΔES1-Tn <0,3 eV) med S1 in Tn54. Poročalo se je, da bi lahko prehode ISC realizirali v majhni energijski vrzeli (ΔES1-Tn <0,3 eV) med S1 in Tn54. Sporočilo, da se lahko prehodi ISC realizirajo v majhnih energetskih celicah (ΔES1-Tn <0,3 эВ) med S1 in Tn54. Poročali so, da je mogoče prehode ISC realizirati v majhni energijski vrzeli (ΔES1-Tn <0,3 eV) med S1 in Tn54.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙９(ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙９(ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。 Sporočilo je bilo, da je lahko prehod ISC realiziran v območju majhnih energetskih celic (ΔES1-Tn < 0,3 эВ) med S1 in Tn54. Poročalo se je, da je prehod ISC mogoče izvesti v majhni energijski vrzeli (ΔES1-Tn <0,3 eV) med S1 in Tn54.Poleg tega se mora samo ena orbitala, zasedena ali nezasedena, razlikovati v vezanih singletnih in tripletnih stanjih, da zagotovi neničelni integral SOC.Tako so na podlagi analize energije vzbujanja in orbitalnega prehoda vsi možni kanali prehoda ISC prikazani na sl.3C,D.Predvsem je v monomeru na voljo samo en kanal ISC, medtem ko ima dimerna oblika štiri kanale ISC, ki lahko izboljšajo prehod ISC.Zato je razumno domnevati, da več kot je agregiranih molekul RuDA, bolj dostopni bodo kanali ISC.Zato lahko agregati RuDA tvorijo dvopasovne elektronske strukture v singletnih in tripletnih stanjih, s čimer se zmanjša energijska vrzel med S1 in razpoložljivim Tn, s čimer se poveča učinkovitost ISC za lažjo generacijo 1O2.
Za nadaljnjo razjasnitev osnovnega mehanizma smo sintetizirali referenčno spojino arene-Ru(II) kompleksa (RuET) z zamenjavo dveh etilnih skupin z dvema trifenilaminskima fenilnima skupinama v RuDA (slika 4A, za popolno karakterizacijo glej ESI, dopolnilo 15). -21 ) Od donorja (dietilamin) do akceptorja (TDF) ima RuET enake intramolekularne značilnosti CT kot RuDA.Kot je bilo pričakovano, je absorpcijski spekter RuET v DMF pokazal nizkoenergijski prenosni pas z močno absorpcijo v bližnjem infrardečem območju v območju 600–1100 nm (slika 4B).Poleg tega so z naraščajočo vsebnostjo vode opazili tudi agregacijo RuET, kar se je odrazilo v rdečem premiku absorpcijskega maksimuma, kar je bilo nadalje potrjeno s slikanjem s tekočim AFM (dopolnilna slika 22).Rezultati kažejo, da lahko RuET, tako kot RuDA, tvori intramolekularna stanja in se samosestavi v agregirane strukture.
Kemijska struktura RuET.B Absorpcijski spektri RuET v mešanicah različnih razmerij DMF in vode.Načrtuje C EIS Nyquist za RuDA in RuET.Odziv fototoka D RuDA in RuET pod delovanjem laserskega sevanja z valovno dolžino 808 nm.
Fotorazgradnjo ABDA v prisotnosti RuET smo ovrednotili z obsevanjem z laserjem z valovno dolžino 808 nm.Presenetljivo ni bilo opaziti razgradnje ABDA v različnih frakcijah vode (dodatna slika 23).Možen razlog je, da RuET ne more učinkovito oblikovati tračne elektronske strukture, ker etilna veriga ne spodbuja učinkovitega medmolekularnega prenosa naboja.Zato so bile za primerjavo fotoelektrokemičnih lastnosti RuDA in RuET izvedene elektrokemična impedančna spektroskopija (EIS) in meritve prehodnega fototoka.Glede na Nyquistov diagram (slika 4C) kaže RuDA veliko manjši radij kot RuET, kar pomeni, da ima RuDA56 hitrejši medmolekularni transport elektronov in boljšo prevodnost.Poleg tega je gostota fototoka RuDA veliko višja od gostote RuET (slika 4D), kar potrjuje boljšo učinkovitost prenosa naboja RuDA57.Tako ima fenilna skupina trifenilamina v Oreu pomembno vlogo pri zagotavljanju medmolekularnega prenosa naboja in oblikovanju trakaste elektronske strukture.
Da bi povečali kopičenje tumorja in biokompatibilnost in vivo, smo dodatno inkapsulirali RuDA s F127.Povprečni hidrodinamični premer RuDA-NP je bil 123,1 nm z ozko porazdelitvijo (PDI = 0,089) z uporabo metode dinamičnega sipanja svetlobe (DLS) (slika 5A), ki je spodbujala kopičenje tumorja s povečanjem prepustnosti in zadrževanja.EPR).Slike TEM so pokazale, da imajo Ore NP enotno sferično obliko s povprečnim premerom 86 nm.Predvsem se je absorpcijski maksimum RuDA-NP pojavil pri 800 nm (dodatna slika 24), kar kaže, da lahko RuDA-NP ohranijo funkcije in lastnosti samosestavljajočih RuDA.Izračunani kvantni izkoristek ROS za NP Ore je 15,9 %, kar je primerljivo z Ore. Fototermične lastnosti RuDA NP so proučevali pod delovanjem laserskega sevanja z valovno dolžino 808 nm z uporabo infrardeče kamere.Kot je prikazano na sl.5B, C je kontrolna skupina (samo PBS) doživela rahlo zvišanje temperature, medtem ko se je temperatura raztopine RuDA-NPs hitro povečala z naraščajočo temperaturo (ΔT) na 15,5, 26,1 in 43,0 °C.Visoke koncentracije so bile 25, 50 oziroma 100 µM, kar kaže na močan fototermični učinek RuDA NP.Poleg tega so bile opravljene meritve cikla ogrevanja/hlajenja za oceno fototermične stabilnosti RuDA-NP in primerjavo z ICG.Temperatura NP-jev rude se po petih ciklih segrevanja/hlajenja ni znižala (slika 5D), kar kaže na odlično fototermično stabilnost NP-jev rude.Nasprotno pa ima ICG nižjo fototermično stabilnost, kot je razvidno iz navideznega izginotja fototermične temperaturne plošče pod enakimi pogoji.V skladu s prejšnjo metodo58 je bila učinkovitost fototermične pretvorbe (PCE) RuDA-NP izračunana na 24,2%, kar je višje od obstoječih fototermičnih materialov, kot so zlate nanopalice (21,0%) in zlate nanolupine (13,0%)59.Tako ima NP Ore odlične fototermične lastnosti, zaradi česar so obetavna PTT sredstva.
Analiza DLS in TEM slik RuDA NP (vložek).B Toplotne slike različnih koncentracij RuDA NP, izpostavljenih laserskemu sevanju pri valovni dolžini 808 nm (0,5 W cm-2).C Fototermične pretvorbene krivulje različnih koncentracij rudnih NČ, ki so kvantitativni podatki.B. D Povišanje temperature ORE NP in ICG v 5 ciklih segrevanja-hlajenja.
Fotocitotoksičnost RuDA NP proti MDA-MB-231 človeškim rakavim celicam dojke je bila ocenjena in vitro.Kot je prikazano na sl.6A, B sta RuDA-NP in RuDA pokazala zanemarljivo citotoksičnost v odsotnosti obsevanja, kar kaže na nižjo temno toksičnost RuDA-NP in RuDA.Vendar sta po izpostavitvi laserskemu sevanju pri valovni dolžini 808 nm RuDA in RuDA NP pokazala močno fotocitotoksičnost proti rakavim celicam MDA-MB-231 z vrednostmi IC50 (polovična največja inhibitorna koncentracija) 5,4 oziroma 9,4 μM, kar dokazuje da imata RuDA-NP in RuDA potencial za fototerapijo raka.Poleg tega so fotocitotoksičnost RuDA-NP in RuDA dodatno raziskali v prisotnosti vitamina C (Vc), čistilca ROS, da bi pojasnili vlogo ROS pri citotoksičnosti, ki jo povzroča svetloba.Očitno se je viabilnost celic povečala po dodatku Vc in vrednosti IC50 RuDA in RuDA NPs so bile 25,7 oziroma 40,0 μM, kar dokazuje pomembno vlogo ROS pri fotocitotoksičnosti RuDA in RuDA NP.Svetlobno povzročena citotoksičnost RuDA-NP in RuDA v rakavih celicah MDA-MB-231 z obarvanjem živih/mrtvih celic z uporabo kalceina AM (zelena fluorescenca za žive celice) in propidijevega jodida (PI, rdeča fluorescenca za mrtve celice).potrjeno s celicami) kot fluorescentne sonde.Kot je prikazano na sliki 6C, so celice, obdelane z RuDA-NP ali RuDA, ostale sposobne preživeti brez obsevanja, kar dokazuje intenzivna zelena fluorescenca.Nasprotno, pri laserskem obsevanju so opazili le rdečo fluorescenco, kar potrjuje učinkovito fotocitotoksičnost RuDA ali RuDA NP.Omeniti velja, da se je ob dodatku Vc pojavila zelena fluorescenca, kar kaže na kršitev fotocitotoksičnosti RuDA in RuDA NP.Ti rezultati so skladni s testi fotocitotoksičnosti in vitro.
Od odmerka odvisna sposobnost preživetja celic A RuDA- in B RuDA-NP v celicah MDA-MB-231 v prisotnosti oziroma odsotnosti Vc (0,5 mM).Vrstice napak, povprečje ± standardni odklon (n = 3). Neparni, dvostranski t testi *p < 0,05, **p < 0,01 in ***p < 0,001. Neparni, dvostranski t testi *p < 0,05, **p < 0,01 in ***p < 0,001. Neparnostni dvostranski t-kriteriji *p <0,05, **p <0,01 in ***p <0,001. Neparni dvostranski t-testi *p<0,05, **p<0,01 in ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Neparnye dvostranski t-test *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Neparni dvostranski t-testi *p<0,05, **p<0,01 in ***p<0,001.C Analiza obarvanja živih/mrtvih celic z uporabo kalceina AM in propidijevega jodida kot fluorescentnih sond.Merilna lestvica: 30 µm.Prikazane so reprezentativne slike treh bioloških ponovitev iz vsake skupine.D Konfokalne fluorescenčne slike proizvodnje ROS v celicah MDA-MB-231 pod različnimi pogoji zdravljenja.Zelena fluorescenca DCF kaže na prisotnost ROS.Obsevamo z laserjem z valovno dolžino 808 nm z močjo 0,5 W/cm2 10 minut (300 J/cm2).Merilna lestvica: 30 µm.Prikazane so reprezentativne slike treh bioloških ponovitev iz vsake skupine.E Analiza zdravljenja s pretočno citometrijo RuDA-NPs (50 µM) ali RuDA (50 µM) z ali brez 808 nm laserja (0,5 W cm-2) v prisotnosti in odsotnosti Vc (0,5 mM) 10 minut.Prikazane so reprezentativne slike treh bioloških ponovitev iz vsake skupine.F Nrf-2, HSP70 in HO-1 celic MDA-MB-231, obdelanih z RuDA-NP (50 µM) z ali brez laserskega obsevanja 808 nm (0,5 W cm-2, 10 min, 300 J cm-2), celice izražajo 2).Prikazane so reprezentativne slike dveh bioloških ponovitev iz vsake skupine.
Znotrajcelično produkcijo ROS v celicah MDA-MB-231 smo pregledali z metodo obarvanja z 2,7-diklorodihidrofluorescein diacetatom (DCFH-DA).Kot je prikazano na sl.Kot je prikazano na sliki 6D, so celice, obdelane z RuDA-NP ali RuDA, pokazale izrazito zeleno fluorescenco, ko so bile obsevane z 808 nm laserjem, kar kaže, da imata RuDA-NP in RuDA učinkovito sposobnost ustvarjanja ROS.Nasprotno, v odsotnosti svetlobe ali v prisotnosti Vc so opazili le šibek fluorescentni signal celic, kar je kazalo na rahlo tvorbo ROS.Znotrajcelične ravni ROS v celicah RuDA-NP in celicah MDA-MB-231, zdravljenih z RuDA, so bile nadalje določene s pretočno citometrijo.Kot je prikazano na dodatni sliki 25, se je povprečna intenzivnost fluorescence (MFI), ki jo ustvarijo RuDA-NP in RuDA pod 808 nm laserskim obsevanjem, znatno povečala za približno 5,1 oziroma 4,8-krat v primerjavi s kontrolno skupino, kar potrjuje njihovo odlično tvorbo AFK.zmogljivost.Vendar so bile znotrajcelične ravni ROS v celicah RuDA-NP ali MDA-MB-231, zdravljenih z RuDA, primerljive samo s kontrolami brez laserskega obsevanja ali v prisotnosti Vc, podobno kot rezultati konfokalne fluorescenčne analize.
Pokazalo se je, da so mitohondriji glavna tarča Ru(II)-aren kompleksov60.Zato je bila raziskana podcelična lokalizacija RuDA in RuDA-NP.Kot je prikazano na dodatni sliki 26, RuDA in RuDA-NP kažeta podobne profile celične porazdelitve z največjim kopičenjem v mitohondrijih (62,5 ± 4,3 oziroma 60,4 ± 3,6 ng/mg beljakovin).Vendar je bila le majhna količina Ru najdena v jedrskih frakcijah Ore in NP Ore (3,5 oziroma 2,1 %).Preostala celična frakcija je vsebovala preostali rutenij: 31,7 % (30,6 ± 3,4 ng/mg beljakovin) za RuDA in 42,9 % (47,2 ± 4,5 ng/mg beljakovin) za RuDA-NP.Na splošno se Ore in NP Ore v glavnem kopičijo v mitohondrijih.Za oceno mitohondrijske disfunkcije smo uporabili obarvanje JC-1 in MitoSOX Red za oceno potenciala mitohondrijske membrane oziroma zmogljivosti proizvodnje superoksida.Kot je prikazano na dodatni sliki 27, so opazili intenzivno zeleno (JC-1) in rdečo (MitoSOX Red) fluorescenco v celicah, obdelanih z RuDA in RuDA-NP pod laserskim obsevanjem 808 nm, kar kaže, da sta tako RuDA kot RuDA-NP visoko fluorescentna. Lahko učinkovito inducira depolarizacijo mitohondrijske membrane in proizvodnjo superoksida.Poleg tega je bil mehanizem celične smrti določen z uporabo analize aneksina V-FITC/propidijevega jodida (PI) na osnovi pretočne citometrije.Kot je prikazano na sliki 6E, sta pri obsevanju z 808 nm laserjem RuDA in RuDA-NP povzročila znatno povečano stopnjo zgodnje apoptoze (spodnji desni kvadrant) v celicah MDA-MB-231 v primerjavi z laserjem PBS ali PBS plus.predelane celice.Ko pa je bil dodan Vc, se je stopnja apoptoze RuDA in RuDA-NP znatno zmanjšala s 50,9 % in 52,0 % na 15,8 % oziroma 17,8 %, kar potrjuje pomembno vlogo ROS pri fotocitotoksičnosti RuDA in RuDA-NP..Poleg tega so opazili rahle nekrotične celice v vseh testiranih skupinah (zgornji levi kvadrant), kar kaže na to, da je apoptoza morda prevladujoča oblika celične smrti, ki jo povzročita RuDA in RuDA-NP.
Ker je poškodba zaradi oksidativnega stresa glavna determinanta apoptoze, je bil jedrski faktor, povezan z eritroidom 2, faktor 2 (Nrf2) 62, ključnim regulatorjem antioksidativnega sistema, raziskan v MDA-MB-231, zdravljenem z RuDA-NPs.Mehanizem delovanja RuDA NP, ki ga povzroča obsevanje.Istočasno je bila odkrita tudi ekspresija spodnjega proteina heme oksigenaze 1 (HO-1).Kot je prikazano na sliki 6F in dodatni sliki 29, je fototerapija, posredovana z RuDA-NP, povečala ravni izražanja Nrf2 in HO-1 v primerjavi s skupino PBS, kar kaže, da lahko RuDA-NP stimulirajo signalne poti oksidativnega stresa.Poleg tega je bila za preučevanje fototermalnega učinka RuDA-NPs63 ovrednotena tudi ekspresija proteina toplotnega šoka Hsp70.Jasno je, da so celice, zdravljene z RuDA-NPs + 808 nm laserskim obsevanjem, pokazale povečano izražanje Hsp70 v primerjavi z drugima dvema skupinama, kar odraža celični odziv na hipertermijo.
Izjemni in vitro rezultati so nas spodbudili, da raziščemo delovanje RuDA-NP in vivo pri golih miših s tumorji MDA-MB-231.Tkivno porazdelitev RuDA NPs smo preučevali z določanjem vsebnosti rutenija v jetrih, srcu, vranici, ledvicah, pljučih in tumorjih.Kot je prikazano na sl.Kot je prikazano na sliki 7A, se je največja vsebnost Ore NP v normalnih organih pojavila ob prvem času opazovanja (4 ure), medtem ko je bila največja vsebnost določena v tumorskih tkivih 8 ur po injiciranju, verjetno zaradi Ore NP.EPR učinek LF.Glede na rezultate porazdelitve je bilo optimalno trajanje zdravljenja z NP rudo 8 ur po dajanju.Za ponazoritev procesa kopičenja RuDA-NP na mestih tumorja smo fotoakustične (PA) lastnosti RuDA-NP spremljali s snemanjem PA signalov RuDA-NP v različnih časih po injiciranju.Najprej je bil signal PA RuDA-NP in vivo ocenjen s snemanjem PA slik mesta tumorja po intratumoralni injekciji RuDA-NP.Kot je prikazano na dodatni sliki 30, so RuDA-NP pokazali močan signal PA in obstajala je pozitivna korelacija med koncentracijo RuDA-NP in intenzivnostjo signala PA (dodatna slika 30A).Nato so bile in vivo posnete PA slike tumorskih mest po intravenskem injiciranju RuDA in RuDA-NP v različnih časovnih točkah po injiciranju.Kot je prikazano na sliki 7B, se je signal PA RuDA-NP iz mesta tumorja postopoma povečeval s časom in dosegel plato 8 ur po injiciranju, kar je skladno z rezultati porazdelitve v tkivu, določenimi z analizo ICP-MS.V zvezi z RuDA (dodatna slika 30B) se je največja intenzivnost signala PA pojavila 4 ure po injiciranju, kar kaže na hitro hitrost vstopa RuDA v tumor.Poleg tega so raziskali izločevalno obnašanje RuDA in RuDA-NP z določanjem količine rutenija v urinu in blatu z uporabo ICP-MS.Glavna pot izločanja za RuDA (dodatna slika 31) in RuDA-NP (slika 7C) je preko blata, učinkovit očistek RuDA in RuDA-NP pa so opazili med 8-dnevnim obdobjem študije, kar pomeni, da je RuDA in RuDA-NP se lahko učinkovito izločijo iz telesa brez dolgotrajne toksičnosti.
A. Ex vivo porazdelitev RuDA-NP v mišjih tkivih je bila določena z vsebnostjo Ru (odstotek apliciranega odmerka Ru (ID) na gram tkiva) ob različnih časih po injiciranju.Podatki so povprečje ± standardni odklon (n = 3). Neparni, dvostranski t testi *p < 0,05, **p < 0,01 in ***p < 0,001. Neparni, dvostranski t testi *p < 0,05, **p < 0,01 in ***p < 0,001. Neparnostni dvostranski t-kriteriji *p <0,05, **p <0,01 in ***p <0,001. Neparni dvostranski t-testi *p<0,05, **p<0,01 in ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Neparnye dvostranski t-test *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Neparni dvostranski t-testi *p<0,05, **p<0,01 in ***p<0,001.BPA slike in vivo tumorskih mest pri 808 nm vzbujanju po intravenskem dajanju RuDA-NP (10 µmol kg-1) v različnih časovnih točkah.Po intravenskem dajanju RuDA NP (10 µmol kg-1) se je C Ru izločal iz miši z urinom in blatom v različnih časovnih intervalih.Podatki so povprečje ± standardni odklon (n = 3).
Zmogljivost segrevanja RuDA-NP in vivo so za primerjavo preučevali na golih miših s tumorji MDA-MB-231 in RuDA.Kot je prikazano na sl.8A in dodatni sliki 32 je kontrolna skupina (fiziološka raztopina) pokazala manjšo spremembo temperature (ΔT ≈ 3 °C) po 10 minutah neprekinjene izpostavljenosti.Vendar se je temperatura RuDA-NP in RuDA hitro povečala z najvišjimi temperaturami 55, 2 oziroma 49, 9 ° C, kar je zagotovilo zadostno hipertermijo za zdravljenje raka in vivo.Opaženo zvišanje visoke temperature za RuDA NP (ΔT ≈ 24 °C) v primerjavi z RuDA (ΔT ≈ 19 °C) je lahko posledica njegove boljše prepustnosti in kopičenja v tumorskih tkivih zaradi učinka EPR.
Infrardeče toplotne slike miši s tumorji MDA-MB-231, obsevane z 808 nm laserjem ob različnih časih 8 ur po injiciranju.Prikazane so reprezentativne slike štirih bioloških ponovitev iz vsake skupine.B Relativni volumen tumorja in C Povprečna masa tumorja različnih skupin miši med zdravljenjem.D Krivulje telesne teže različnih skupin miši.Obsevamo z laserjem z valovno dolžino 808 nm z močjo 0,5 W/cm2 10 minut (300 J/cm2).Vrstice napak, povprečje ± standardni odklon (n = 3). Neparni, dvostranski t testi *p < 0,05, **p < 0,01 in ***p < 0,001. Neparni, dvostranski t testi *p < 0,05, **p < 0,01 in ***p < 0,001. Neparnostni dvostranski t-kriteriji *p <0,05, **p <0,01 in ***p <0,001. Neparni dvostranski t-testi *p<0,05, **p<0,01 in ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Neparnye dvostranski t-test *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Neparni dvostranski t-testi *p<0,05, **p<0,01 in ***p<0,001. Slike obarvanja E H&E glavnih organov in tumorjev iz različnih skupin zdravljenja, vključno s skupinami fiziološke raztopine, fiziološke raztopine + laserja, RuDA, RuDA + laserja, RuDA-NP in RuDA-NP + laserja. Slike obarvanja E H&E glavnih organov in tumorjev iz različnih skupin zdravljenja, vključno s skupinami fiziološke raztopine, fiziološke raztopine + laserja, RuDA, RuDA + laserja, RuDA-NP in RuDA-NP + laserja. Slike okraševanja E H&E glavnih in organov opuholej iz različnih skupin zdravljenja, vključno s skupinami fiziološke raztopine, fiziološke raztopine + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NPs in RuDA-NPs + laser. Slike obarvanja E H&E glavnih organov in tumorjev iz različnih skupin zdravljenja, vključno s skupinami fiziološka raztopina, fiziološka raztopina + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NP in RuDA-NP + laser.来自 不同 治疗 组 的 器官 和 肿瘤 的 的 e h & e 染色 图像 ， 包括 盐水 、 、 水 水 + 激光 、 、 ruda 、 ruda + 激光 、 ruda-nps 和 ruda-nps + 激光组。来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Okrašivanje E H&E glavnih organov in opuholej iz različnih skupin zdravljenja, vključno s fiziološko raztopino, fiziološko raztopino + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NPs in RuDA-NPs + laser. E H&E barvanje večjih organov in tumorjev iz različnih skupin zdravljenja, vključno s fiziološko raztopino, fiziološko raztopino + laserjem, RuDA, RuDA + laserjem, RuDA-NPs in RuDA-NPs + laserjem.Merilna lestvica: 60 µm.
Učinek fototerapije in vivo z RuDA in RuDA NPs je bil ocenjen, pri čemer so golim mišim s tumorji MDA-MB-231 intravensko injicirali RuDA ali RuDA NPs v enkratnem odmerku 10,0 µmol kg-1 preko repne vene in nato 8 ure po injiciranju.lasersko obsevanje z valovno dolžino 808 nm.Kot je prikazano na sliki 8B, so se volumni tumorja znatno povečali v skupinah s fiziološko raztopino in laserjem, kar kaže, da je obsevanje s fiziološko raztopino ali laserjem 808 le malo vplivalo na rast tumorja.Tako kot v skupini s fiziološko raztopino so hitro rast tumorja opazili tudi pri miših, zdravljenih z RuDA-NP ali RuDA v odsotnosti laserskega obsevanja, kar dokazuje njihovo nizko toksičnost za temo.V nasprotju s tem sta po laserskem obsevanju zdravljenje z RuDA-NP in RuDA povzročila znatno regresijo tumorja z zmanjšanjem volumna tumorja za 95,2 % oziroma 84,3 % v primerjavi s skupino, zdravljeno s fiziološko raztopino, kar kaže na odlično sinergistično PDT., posredovan z učinkom RuDA/CHTV.– NP ali Ore. V primerjavi z RuDA so NP RuDA pokazali boljši fototerapevtski učinek, kar je bilo predvsem posledica EPR učinka NP RuDA.Rezultati zaviranja rasti tumorja so bili nadalje ocenjeni s težo tumorja, izrezanega 15. dan zdravljenja (slika 8C in dopolnilna slika 33).Povprečna masa tumorja pri miših, zdravljenih z RuDA-NP, in miših, zdravljenih z RuDA, je bila 0,08 oziroma 0,27 g, kar je bilo veliko manj kot v kontrolni skupini (1,43 g).
Poleg tega so telesno težo miši zabeležili vsake tri dni, da bi preučili temno toksičnost RuDA-NP ali RuDA in vivo.Kot je prikazano na sliki 8D, niso opazili pomembnih razlik v telesni teži za vse zdravljene skupine. Poleg tega je bilo opravljeno barvanje s hematoksilinom in eozinom (H&E) glavnih organov (srce, jetra, vranica, pljuča in ledvice) iz različnih zdravljenih skupin. Poleg tega je bilo izvedeno barvanje s hematoksilinom in eozinom (H&E) glavnih organov (srce, jetra, vranica, pljuča in ledvice) iz različnih zdravljenih skupin. Poleg tega je bilo izvedeno okrevanje glavnih organov (hematoksilinom in eozinom (H&E) (srčka, pečenki, selezenki, lahki in počak)) iz različnih skupin zdravljenja. Poleg tega je bilo opravljeno obarvanje glavnih organov (srce, jetra, vranica, pljuča in ledvice) s hematoksilinom in eozinom (H&E) iz različnih zdravljenih skupin.此外，对不同治疗组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进行苏木精和伊红(H&E) 染色。 (H&E) Poleg tega so izvajali okrevanje z gematoksilinom in eozinom (H&E) glavnih organov (srce, pečenje, selezenki, lahkih in počakov) v različnih skupinah zdravljenja. Poleg tega so v različnih zdravljenih skupinah izvedli obarvanje glavnih organov (srce, jetra, vranica, pljuča in ledvice) s hematoksilinom in eozinom (H&E).Kot je prikazano na sl.Na sliki 8E slike obarvanja s H&E petih glavnih organov iz skupin RuDA-NP in RuDA ne kažejo očitnih nepravilnosti ali poškodb organov. Na sliki 8E slike obarvanja s H&E petih glavnih organov iz skupin RuDA-NP in RuDA ne kažejo očitnih nepravilnosti ali poškodb organov.Kot je prikazano na sl.8E, slike okrašenih H&E petih glavnih organov iz skupine RuDA-NPs in RuDA ne kažejo očitnih anomalij ali poškodb organov. 8E, slike obarvanja s H&E petih glavnih organov iz skupin RuDA-NP in RuDA ne kažejo očitnih nepravilnosti ali poškodb organov.如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有显示出明显的异常或器官损如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E Kot je prikazano na sliki 8E, slike okrašenih H&E petih glavnih organov iz skupine RuDA-NPs in RuDA niso pokazale jasne anomalije ali poškodbe. Kot je prikazano na sliki 8E, slike obarvanja s H&E petih glavnih organov iz skupin RuDA-NP in RuDA niso pokazale očitnih nepravilnosti ali poškodb organov.Ti rezultati so pokazali, da niti RuDA-NP niti RuDA nista pokazala znakov toksičnosti in vivo. Poleg tega so slike tumorjev, obarvane s H&E, pokazale, da lahko tako skupini RuDA + Laser kot RuDA-NPs + Laser povzročita hudo uničenje rakavih celic, kar dokazuje odlično in vivo fototerapevtsko učinkovitost RuDA in RuDA-NP. Poleg tega so slike tumorjev, obarvane s H&E, pokazale, da lahko tako skupini RuDA + Laser kot RuDA-NPs + Laser povzročita hudo uničenje rakavih celic, kar dokazuje odlično in vivo fototerapevtsko učinkovitost RuDA in RuDA-NP.Poleg tega so slike tumorjev, obarvane s hematoksilinom in eozinom, pokazale, da lahko tako skupini RuDA+Laser kot RuDA-NPs+Laser povzročita hudo uničenje rakavih celic, kar dokazuje vrhunsko fototerapevtsko učinkovitost RuDA in RuDA-NP in vivo.此外 ， 的 的 h & e 染色 图像 显示 ， ， ruda + laser 和 ruda-nps + laser 组均 可 导致 严重 的 癌细胞 ， ， 证明 了 了 ruda 和 ruda-nps 的 优异 优异 的 光疗。。。。。。。。。。。。。。。此外 ， 的 的 & e 染色 显示 ， ruda + laser 和 ruda-nps + laser 组均 导致 的 癌 癌 细胞 破坏 证明 了 了 了 ruda 和 ruda-nps 的 的 体内 体内 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 . . . .Poleg tega so slike tumorjev, obarvane s hematoksilinom in eozinom, pokazale, da sta skupini RuDA+Laser in RuDA-NPs+Laser povzročili hudo uničenje rakavih celic, kar dokazuje vrhunsko fototerapevtsko učinkovitost RuDA in RuDA-NP in vivo.
Skratka, organokovinski kompleks Ru(II)-arena (RuDA) z ligandi tipa DA je bil zasnovan za olajšanje procesa ISC z uporabo metode agregacije.Sintetizirana RuDA se lahko sama sestavi z nekovalentnimi interakcijami, da tvori nadmolekularne sisteme, ki izhajajo iz RuDA, s čimer olajša tvorbo 1O2 in učinkovito fototermično pretvorbo za svetlobno povzročeno terapijo raka.Omeniti velja, da monomerni RuDA ni ustvaril 1O2 pod laserskim obsevanjem pri 808 nm, lahko pa je ustvaril veliko količino 1O2 v agregatnem stanju, kar dokazuje racionalnost in učinkovitost naše zasnove.Poznejše študije so pokazale, da supramolekularni sklop daje RuDA izboljšane fotofizikalne in fotokemične lastnosti, kot sta absorpcija rdečega premika in odpornost proti beljenju, ki sta zelo zaželeni za obdelavo PDT in PTT.Tako in vitro kot in vivo poskusi so pokazali, da RuDA NP z dobro biokompatibilnostjo in dobrim kopičenjem v tumorju kažejo odlično svetlobno inducirano protirakavo aktivnost pri laserskem obsevanju pri valovni dolžini 808 nm.Tako bodo RuDA NP kot učinkoviti bimodalni supramolekularni reagenti PDT/PTW obogatili nabor fotosenzibilizatorjev, aktiviranih pri valovnih dolžinah nad 800 nm.Konceptualna zasnova supramolekularnega sistema zagotavlja učinkovito pot za fotosenzibilizatorje, aktivirane z NIR, z odličnimi učinki fotosenzibilizacije.
Vse kemikalije in topila so bili pridobljeni od komercialnih dobaviteljev in uporabljeni brez nadaljnjega čiščenja.RuCl3 je bil kupljen pri Boren Precious Metals Co., Ltd. (Kunming, Kitajska).[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolin-5,6-dion) in 4,7-bis[4-(N,N-difenilamino)fenil]-5 ,6-Diamino-2,1,3-benzotiadiazol je bil sintetiziran v skladu s prejšnjimi študijami64,65.NMR spektri so bili posneti na spektrometru Bruker Avance III-HD 600 MHz v analitičnem testnem centru Southeastern University z uporabo d6-DMSO ali CDCl3 kot topila.Kemični premiki δ so podani v ppm.glede na tetrametilsilan, interakcijske konstante J pa so podane v absolutnih vrednostih v hercih.Masna spektrometrija visoke ločljivosti (HRMS) je bila izvedena na instrumentu Agilent 6224 ESI/TOF MS.Elementno analizo C, H in N smo izvedli na elementnem analizatorju Vario MICROCHNOS (Elementar).UV-vidni spektri so bili izmerjeni na spektrofotometru Shimadzu UV3600.Fluorescenčni spektri so bili posneti na spektrofluorimetru Shimadzu RF-6000.Spektri EPR so bili posneti na instrumentu Bruker EMXmicro-6/1.Morfologijo in strukturo pripravljenih vzorcev smo proučevali na instrumentih FEI Tecnai G20 (TEM) in Bruker Icon (AFM), ki delujeta pri napetosti 200 kV.Dinamično sipanje svetlobe (DLS) je bilo izvedeno na analizatorju Nanobrook Omni (Brookhaven).Fotoelektrokemične lastnosti so bile izmerjene na elektrokemični napravi (CHI-660, Kitajska).Fotoakustične slike so bile pridobljene s sistemom FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR.Konfokalne slike so bile pridobljene s konfokalnim mikroskopom Olympus FV3000.Analiza FACS je bila izvedena na pretočnem citometru BD Calibur.Poskusi s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) so bili izvedeni na sistemu Waters Alliance e2695 z uporabo detektorja 2489 UV/Vis.Preskusi gelske permeacijske kromatografije (GPC) so bili posneti na instrumentu Thermo ULTIMATE 3000 z uporabo detektorja lomnega indeksa ERC RefratoMax520.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolin-5,6-dion)64 (481,0 mg, 1,0 mmol), 4,7-bis[4 -(N, N-difenilamino)fenil]-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol 65 (652,0 mg, 1,0 mmol) in ledocetno kislino (30 ml) smo mešali pri refluksu v hladilniku 12 ur.Topilo nato odstranimo v vakuumu z uporabo rotacijskega uparjalnika.Nastali ostanek smo očistili z bliskovito kolonsko kromatografijo (silikagel, CH2Cl2:MeOH=20:1), da smo dobili RuDA kot zelen prah (dobitek: 877,5 mg, 80 %).anus.Izračunano za C64H48Cl2N8RuS: C 67,84, H 4,27, N 9,89.Ugot.: C 67,92, H 4,26, N 9,82.1H NMR (600 MHz, d6-DMSO) 8 10,04 (s, 2H), 8,98 (s, 2H), 8,15 (s, 2H), 7,79 (s, 4H), 7,44 (s, 8H), 7,21 (d, J = 31,2 Hz, 16H), 6,47 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 2,69 (s, 1H), 2,25 (s, 3H), 0,99 (s, 6H).13C NMR (150 MHz, D6-DMSO), Δ (ppm) 158.03, 152.81, 149.31, 147.98, 147.16, 139.98, 136.21, 135.57, 134.68, 128.120., 128.11, 128,68, 128,68. , 103. , 86.52, 84.75, 63.29, 30.90, 22.29, 18.83.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 1097,25.
Sinteza 4,7-bis[4-(N,N-dietilamino)fenil-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazola (L2): L2 smo sintetizirali v dveh korakih.Pd(PPh3)4 (46 mg, 0,040 mmol) dodamo k N,N-dietil-4-(tributilstanil)anilinu (1,05 g, 2,4 mmol) in 4,7-dibromo-5,6-dinitro raztopini - 2, 1,3-benzotiadiazol (0,38 g, 1,0 mmol) v suhem toluenu (100 ml).Zmes smo mešali pri 100 °C 24 ur.Po odstranitvi toluena v vakuumu smo nastalo trdno snov sprali s petrol etrom.Nato zmes te spojine (234,0 mg, 0,45 mmol) in železovega prahu (0,30 g, 5,4 mmol) v ocetni kislini (20 ml) mešamo pri 80 °C 4 ure.Reakcijsko zmes smo zlili v vodo in nastalo rjavo trdno snov zbrali s filtracijo.Produkt dvakrat očistimo z vakuumsko sublimacijo, da dobimo zeleno trdno snov (126,2 mg, 57% izkoristek).anus.Izračunano za C26H32N6S: C 67,79, H 7,00, N 18,24.Ugot.: C 67,84, H 6,95, H 18,16.1H NMR (600 MHz, CDC13), 5 (ppm) 7,42 (d, 4H), 6,84 (d, 4H), 4,09 (s, 4H), 3,42 (d, 8H), 1,22 (s, 12H).13С NMR (150 MHz, CDC13), 5 (ppm) 151,77, 147,39, 138,07, 131,20, 121,09, 113,84, 111,90, 44,34, 12,77.ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461,24.
Spojine smo pripravili in očistili po postopkih, podobnih RuDA.anus.Izračunano za C48H48Cl2N8RuS: C 61,27, H 5,14, N 11,91.Ugot.: C, 61,32, H, 5,12, N, 11,81, 1H NMR (600 MHz, d6-DMSO), 5 (ppm) 10,19 (s, 2H), 9,28 (s, 2H), 8,09 (s, 2H), 7,95 (s, 4H), 6,93 (s, 4H), 6,48 (d, 2H), 6,34 (s, 2H), 3,54 (t, 8H), 2,80 (m, 1H), 2,33 (s, 3H), 1,31 (t, 12H), 1,07 (s, 6H).13C NMR (151 MHz, CDCL3), Δ (ppm) 158.20, 153.36, 148.82, 148.14, 138.59, 136.79, 135.75, 134.71, 130.44, 128.87, 121,70, 121,74., 38.06, 31.22, 29.69, 22.29, 19.19, 14.98, 12.93.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 905,24.
RuDA smo raztopili v MeOH/H2O (5/95, v/v) pri koncentraciji 10 μM.Absorpcijski spekter RuDA smo merili vsakih 5 minut na spektrofotometru Shimadzu UV-3600 ob obsevanju z lasersko svetlobo z valovno dolžino 808 nm (0,5 W/cm2).Spektri ICG so bili posneti pod enakimi pogoji kot standard.
Spektri EPR so bili posneti na spektrometru Bruker EMXmicro-6/1 z mikrovalovno močjo 20 mW, območjem skeniranja 100 G in modulacijo polja 1 G. 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidon (TEMP) in 5,5-dimetil-1-pirolin N-oksid (DMPO) smo uporabili kot vrtilne pasti.Za mešane raztopine RuDA (50 µM) in TEMF (20 mM) ali DMPO (20 mM) smo posneli spektre elektronske spinske resonance pod delovanjem laserskega sevanja z valovno dolžino 808 nm (0,5 W/cm2).
Izračuni DFT in TD-DFT za RuDA so bili izvedeni na nivojih PBE1PBE/6–31 G*//LanL2DZ v vodni raztopini z uporabo Gaussovega programa 1666,67,68.Porazdelitve HOMO-LUMO, lukenj in elektronov nizkoenergijskega singletno vzbujenega stanja RuDA so bile narisane s programom GaussView (različica 5.0).
Najprej smo poskušali izmeriti učinkovitost generiranja 1O2 RuDA z uporabo običajne UV-vidne spektroskopije z ICG (ΦΔ = 0,002) kot standardom, vendar je fotodegradacija ICG močno vplivala na rezultate.Tako je bil kvantni izkoristek 1O2 RuDA izmerjen z zaznavanjem spremembe intenzitete fluorescence ABDA pri približno 428 nm, ko je bila obsevana z laserjem z valovno dolžino 808 nm (0,5 W/cm2).Poskusi so bili izvedeni na RuDA in RuDA NP (20 μM) v vodi/DMF (98/2, v/v), ki vsebuje ABDA (50 μM).Kvantni izkoristek 1O2 je bil izračunan po naslednji formuli: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS in rICG sta hitrosti reakcije ABDA z 1O2, dobljene iz fotosenzibilizatorja oziroma ICG.APS in AICG sta absorbanca fotosenzibilizatorja in ICG pri 808 nm.
Meritve AFM so bile izvedene v tekočih pogojih z uporabo načina skeniranja na sistemu Bruker Dimension Icon AFM.Z uporabo odprte strukture s tekočimi celicami smo celice dvakrat sprali z etanolom in posušili s tokom dušika.Posušene celice vstavite v optično glavo mikroskopa.Takoj kanite kapljico vzorca v bazen tekočine in ga s sterilno plastično brizgo za enkratno uporabo in sterilno iglo položite na konzolo.Druga kapljica se položi neposredno na vzorec in ko se optična glava spusti, se kapljici združita in tvorita meniskus med vzorcem in rezervoarjem tekočine.Meritve AFM so bile izvedene z uporabo nitridnega konzole SCANASYST-FLUID v obliki črke V (Bruker, trdota k = 0,7 N m-1, f0 = 120–180 kHz).
Kromatogrami HPLC so bili pridobljeni na sistemu Waters e2695, opremljenem s kolono phoenix C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm) z uporabo 2489 UV/Vis detektorja.Valovna dolžina detektorja je 650 nm.Mobilni fazi A in B sta bili voda oziroma metanol, pretok mobilne faze pa je bil 1,0 ml·min-1.Gradient (topilo B) je bil naslednji: 100 % od 0 do 4 minute, 100 % do 50 % od 5 do 30 minut in ponastavitev na 100 % od 31 do 40 minut.Rudo smo raztopili v mešani raztopini metanola in vode (50/50, glede na prostornino) pri koncentraciji 50 μM.Volumen injekcije je bil 20 μl.
GPC testi so bili posneti na instrumentu Thermo ULTIMATE 3000, opremljenem z dvema kolonama PL aquagel-OH MIXED-H (2×300×7,5 mm, 8 µm) in detektorjem lomnega indeksa ERC RefratoMax520.GPC kolono smo eluirali z vodo pri pretoku 1 ml/min pri 30 °C.Ore NPs smo raztopili v raztopini PBS (pH = 7,4, 50 μM), volumen injekcije je bil 20 μL.
Fototokove smo merili na elektrokemični napravi (CHI-660B, Kitajska).Optoelektronski odzivi ob vklopu in izklopu laserja (808 nm, 0,5 W/cm2) so bili izmerjeni pri napetosti 0,5 V v črni skrinjici.Uporabljena je bila standardna celica s tremi elektrodami s stekleno ogljikovo elektrodo (GCE) v obliki črke L kot delovno elektrodo, standardno kalomelno elektrodo (SCE) kot referenčno elektrodo in platinastim diskom kot nasprotno elektrodo.Kot elektrolit smo uporabili 0,1 M raztopino Na2SO4.
Celična linija človeškega raka dojke MDA-MB-231 je bila kupljena pri KeyGEN Biotec Co., LTD (Nanjing, Kitajska, kataloška številka: KG033).Celice smo gojili v monoslojih v Dulbeccovem modificiranem Eagleovem mediju (DMEM, visoka glukoza), dopolnjenem z raztopino 10% fetalnega govejega seruma (FBS), penicilina (100 μg/ml) in streptomicina (100 μg/ml).Vse celice smo gojili pri 37 °C v vlažni atmosferi, ki je vsebovala 5 % CO2.
Test MTT je bil uporabljen za določanje citotoksičnosti RuDA in RuDA-NP v prisotnosti in odsotnosti svetlobnega obsevanja, z ali brez Vc (0,5 mM).Rakave celice MDA-MB-231 smo gojili v ploščah s 96 vdolbinicami pri celični gostoti približno 1 x 105 celic/ml/vdolbinico in jih inkubirali 12 ur pri 37,0 °C v atmosferi s 5 % CO2 in 95 % zraka.Celicam smo dodali RuDA in RuDA NP, raztopljene v vodi.Po 12 urah inkubacije smo celice za 10 minut izpostavili 0,5 W cm -2 laserskemu sevanju pri valovni dolžini 808 nm (300 J cm -2) in jih nato inkubirali v temi 24 ur.Celice smo nato inkubirali z MTT (5 mg/ml) še 5 ur.Nazadnje spremenite medij v DMSO (200 µl), da raztopite nastale škrlatne kristale formazana.Vrednosti OD so bile izmerjene s čitalnikom mikroplošč z valovno dolžino 570/630 nm.Vrednost IC50 za vsak vzorec je bila izračunana s programsko opremo SPSS iz krivulj odmerek-odziv, pridobljenih iz vsaj treh neodvisnih poskusov.
Celice MDA-MB-231 smo obdelali z RuDA in RuDA-NP v koncentraciji 50 μM.Po 12 urah inkubacije smo celice 10 minut obsevali z laserjem z valovno dolžino 808 nm in močjo 0,5 W/cm2 (300 J/cm2).V skupini z vitaminom C (Vc) so celice pred laserskim obsevanjem obdelali z 0,5 mM Vc.Celice smo nato inkubirali v temi dodatnih 24 ur, nato jih 30 minut obarvali s kalceinom AM in propidijevim jodidom (20 μg/ml, 5 μl), nato pa sprali s PBS (10 μl, pH 7,4).slike obarvanih celic.