Novice

Hvala, ker ste obiskali Nature.com.Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS.Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju).Medtem bomo za zagotovitev stalne podpore spletno mesto upodobili brez slogov in JavaScripta.
Rakave celice so razvile različne mehanizme za premagovanje celičnega stresa in nadaljnje napredovanje.Protein kinaza R (PKR) in njen proteinski aktivator (PACT) sta prva odzivnika, ki spremljata različne stresne signale, ki vodijo do zaviranja celične proliferacije in apoptoze.Vendar regulacija poti PACT-PKR v rakavih celicah ostaja večinoma neznana.Tu smo ugotovili, da je dolga nekodirajoča RNA (lncRNA) aspartil tRNA sintetaza protismiselna RNA 1 (DARS-AS1) neposredno vključena v inhibicijo poti PACT-PKR in spodbuja proliferacijo rakavih celic.Z uporabo obsežnega funkcionalnega presejanja lncRNA, povezane z rakom CRISPRi 971, smo ugotovili, da je DARS-AS1 povezan z znatno povečano proliferacijo rakavih celic.Zato izločitev DARS-AS1 zavira celično proliferacijo in spodbuja apoptozo rakavih celic v različnih rakavih celičnih linijah in vitro ter znatno zmanjša rast tumorja in vivo.Mehansko se DARS-AS1 veže neposredno na aktivacijsko domeno PACT in prepreči interakcijo PACT-PKR, s čimer zmanjša aktivacijo PKR, fosforilacijo eIF2α in zavira apoptotično celično smrt.Klinično je DARS-AS1 široko izražen pri več vrstah raka, čezmerna ekspresija te lncRNA pa kaže na slabo prognozo.Ta študija pojasnjuje za raka specifično regulacijo poti PACT-PKR z DARS-AS1 lncRNA in zagotavlja drugo tarčo za prognozo in zdravljenje raka.
Sposobnost prilagajanja stresu je pomembna značilnost preživetja in širjenja rakavih celic.Hitra proliferacija in presnovne značilnosti raka dosežejo vrhunec v težkih mikrookoljih – pomanjkanje hranil, hipoksija in nizek pH –, ki lahko sprožijo signalne poti celične smrti.Disregulacijo genov, občutljivih na stres, kot so p535, proteini toplotnega šoka 6, 7, KRAS8, 9 in HIF-110, 11, 12, 13, pogosto opazimo pri raku, s čimer blokiramo apoptozo in spodbujamo preživetje.
Protein kinaza R (PKR) je pomemben senzor stresa in podenota kinaze evkariontskega iniciacijskega faktorja 2α (eIF2α), translacijskega regulatorja, ki povezuje celični stres s celično smrtjo.PKR je bil prvotno opredeljen kot protivirusni protein z detekcijo tuje dvojnoverižne RNA (dsRNA).Po aktivaciji PKR fosforilira eIF2α, da zavira sintezo virusnih in celičnih beljakovin14,15,16.PACT (protein aktivatorja PKR) je bil identificiran kot prvi protein aktivatorja PKR v odsotnosti dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Z neposredno interakcijo s PKR PACT prenaša različne obremenitve (stradanje seruma, zdravljenje s peroksidom ali arzenitom) na PKR in signalne poti navzdol.Poleg fosforilacije eIF2α aktivacija PKR, ki jo posreduje PACT, sproži različne dogodke, povezane s stresnim odzivom, vključno s spremenjenim redoks statusom prek poti PI3K/Akt24, izboljšanim preverjanjem poškodb DNK prek p5325, 26 in NF-κB27, 28 Uravnava transkripcijo, 29. Glede na njuno ključno vlogo pri odzivu na stres, proliferaciji, apoptozi in drugih ključnih celičnih procesih sta PKR in PACT obetavni terapevtski tarči za številne bolezni, zlasti raka30,31,32,33.Kljub temu pleiotropnemu funkcionalnemu in biološkemu pomenu regulacija aktivnosti PACT/PKR v rakavih celicah ostaja nedosegljiva.
lncRNA so transkripti, večji od 200 nukleotidov, brez potenciala kodiranja beljakovin.Odkar so vrhunski projekti sekvenciranja celotnega genoma identificirali na tisoče lncRNA,35,36 je bilo vloženega veliko truda, da bi razjasnili njihove biološke funkcije.Vse več raziskav je pokazalo, da so lncRNA vključene v številne biološke procese37, vključno z regulacijo inaktivacije X-kromosoma38,39, imprintingom40, transkripcijo41,42, prevajanjem43 in celo rastjo raka44,45,46,47.Te študije so poročale, da je veliko lncRNA vključenih v pot PACT/PKR.Ena taka študija je pokazala, da je lncRNA ASPACT zavirala transkripcijo PACT in povečala jedrsko retenco PACT mRNA.Druge študije so pokazale, da se lncRNA nc886 veže na PKR in zavira njegovo fosforilacijo49,50.Doslej niso poročali o lncRNA, ki uravnava aktivacijo PKR, posredovano s PACT.
Aspartil-tRNA sintetaza antisense RNA 1 (DARS-AS1) je bila identificirana kot onkogena lncRNA51,52,53,54.Z regulacijo miP-194-5p53, miP-12952 in miP-532-3p51 se je pokazalo, da DARS-AS1 spodbuja rast svetloceličnega ledvičnoceličnega karcinoma, karcinoma ščitnice oziroma nedrobnoceličnega karcinoma pljuč.Tong in sodelavci so tudi ugotovili, da DARS-AS1 spodbuja napredovanje mieloma z ohranjanjem stabilnosti RNA-vezavnega motiva proteina 39 (RBM39).Vendar pa niso bile izvedene nobene študije o tem, ali je ta lncRNA vključena v regulacijo aktivacije PACT-PKR in stresnega odziva rakavih celic.
Tu smo s sistemom CRISPRi izvedli obsežen pregled izgube funkcije in ugotovili, da DARS-AS1 lncRNA spodbuja proliferacijo več vrst rakavih celic.Poleg tega smo identificirali glavni mehanizem: DARS-AS1 se veže neposredno na PACT, zavira vezavo PACT in PKR, preprečuje fosforilacijo eIF2α, nižjega substrata PKR, in na koncu zavira apoptotično celično smrt.Na koncu naše delo razkriva DARS-AS1 lncRNA kot regulator poti PACT-PKR in potencialno tarčo za zdravljenje in prognozo raka.
Obsežne študije genomskega profiliranja so odkrile na stotine lncRNA, povezanih z rakom.Vendar ostaja njihova funkcija večinoma neznana56.Za identifikacijo obetavnih kandidatov za lncRNA, ki sodelujejo pri napredovanju raka, smo izvedli pregled izgube funkcije za zmanjšano proliferacijo v celični liniji raka debelega črevesa in danke SW620 z uporabo sistema CRISPRi (slika 1a).Edinstvena značilnost celičnih linij raka debelega črevesa SW480 in SW620 je, da izhajajo iz primarnih in sekundarnih tumorjev pri enem bolniku.To zagotavlja dragoceno primerjavo za preučevanje genetskih sprememb pri napredovanju napredovalega raka debelega črevesa.Zato smo analizirali transkriptome celičnih linij raka debelega črevesa in danke (SW480 in SW620) z uporabo sekvenciranja RNA in zbrali nekaj potencialnih funkcionalnih lncRNA iz objavljene literature.Na podlagi teh rezultatov smo oblikovali združeno knjižnico sgRNA, ki vsebuje 7355 oligov sgRNA, ki ciljajo na 971 lncRNA, povezanih z rakom, in 500 neciljanih oligov sgRNA za negativno kontrolo (dodatni podatki 1).
Shematski prikaz presejanja s sistemom CRISPRi.b obogatitev sgRNA po presejanju.Vodoravna črtkana črta predstavlja log2 (sprememba pregiba) = ±0,58.Navpična črtkana črta označuje vrednost p = 0,05.Črne pike predstavljajo netarčno sgRNA (označeno kot NC).Rdeče pike so sgRNA, ki ciljajo na DARS-AS1.Modre pike so sgRNA, ki ciljajo na LINC00205, prej opisano onkogeno lncRNA.sprememba gube = (normaliziran odčitek, 17. dan)/(normaliziran odčitek, dan 0).c Razpad sgRNA DARS-AS1 je zaviral rast celic.Vrstice napak predstavljajo ± standardni odklon treh poskusov.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 dvostranski Studentov t-test.d Ekspresija DARS-AS1 v tumorjih (nabor podatkov TCGA).em Izražanje DARS-AS1 v parnih normalnih in tumorskih vzorcih bolnikov z BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP oziroma COAD (nabor podatkov TCGA).p-vrednosti so bile pridobljene z uporabo parnega dvostranskega Studentovega t-testa.
Po konstruiranju plazmida in pakiranju lentivirusa smo transducirali celično linijo raka debelega črevesa in danke dCas9-SW620 z zgornjo knjižnico v štirih neodvisnih poskusih okužbe.Množica okužbe (MOI) za te okužbe je bila 0,1–0,3, kar kaže, da je vsako celico mogoče transfektirati samo z eno sgRNA.Po 18 dneh kulture in vitro se je obogatitveni profil ciljnih sgRNA po presejanju zmanjšal ali povečal, medtem ko je število neciljanih kontrolnih oligonukleotidov ostalo relativno nespremenjeno v primerjavi s profilom pred presejanjem, kar kaže, da ima naša tarča zelo specifičen zaslon knjižnica.riž.1b in dodatna tabela 1). LINC00205, za katerega so prej poročali, da spodbuja pljučni rak in napredovanje raka jeter 58, 59, 60, je bil presejan (log2 (foldchange) < -0,58, p vrednost <0,05), kar potrjuje zanesljivost tega presejanja (slika 1b). LINC00205, za katerega so prej poročali, da spodbuja pljučni rak in napredovanje raka jeter 58, 59, 60, je bil presejan (log2 (foldchange) < -0,58, p vrednost <0,05), kar potrjuje zanesljivost tega presejanja (slika 1b). LINC00205, o katerem je bilo prej objavljeno, da je možno napredovanje raka lahkih in raka pečenih 58, 59, 60, je bil izključen (log2 (kratna sprememba) <-0,58, vrednost p <0,05), kar potrjuje zanesljivost tega skrininga (ris 1b). LINC00205, za katerega so prej poročali, da spodbuja napredovanje pljučnega in jetrnega raka 58, 59, 60, je bil izključen (log2 (kratna sprememba) <-0,58, p-vrednost <0,05), kar potrjuje robustnost tega presejanja (slika .1b) . LINC00205 之前 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （（log2 （变化））））））））） ， -0,58 ， P 值 <0,05） ， 证实 该 筛选 可靠性 （（（图 1B。。 该 （（图 1B。 LINC00205 之前 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （（log2 （变化））））））））） ， -0,58 ， P 值 <0,05） ， 证实 该 筛选 可靠性 （（（图 1B。。 该 （（图 1B。 LINC00205, o katerem je bilo prej objavljeno, da lahko napreduje pri lahkih in pečenih rakah 58, 59, 60, je bil izključen (log2 (kratka sprememba) <-0,58, p-pomen <0,05), kar potrjuje zanesljivost tega skrininga (ris 1b). LINC00205, za katerega so prej poročali, da spodbuja napredovanje pljučnega in jetrnega raka 58, 59, 60, je bil izključen (log2 (kratna sprememba) <-0,58, p-vrednost <0,05), kar potrjuje robustnost tega presejanja (slika .1b).
Med vsemi testiranimi lncRNA je bil pregledan tudi DARS-AS1, pri čemer so bili trije sorodni oligonukleotidi sgRNA znatno zmanjšani po 18 dneh gojenja, kar kaže, da je knockdown te lncRNA povzročil zmanjšano proliferacijo raka (slika 1b).Ta rezultat je bil dodatno podprt z analizo MTS v celicah raka debelega črevesa in danke, ki je pokazala, da je bila stopnja rasti izločenih celic DARS-AS1 le prepolovljena v primerjavi s kontrolnimi celicami (slika 1c) in je bila skladna s prejšnjimi poročili o več drugih vrstah raka.: svetlocelični rak ledvic, rak ščitnice in nedrobnocelični pljučni rak51,52,53,55.Vendar njegova funkcija in molekularni mehanizmi pri kolorektalnem raku ostajajo neraziskani.Zato smo izbrali to lncRNA za nadaljnjo študijo.
Za preučevanje izražanja DARS-AS1 pri bolnikih smo celovito analizirali 10.327 vzorcev tumorjev iz projekta Atlas genoma raka (TCGA).Naši rezultati kažejo, da je DARS-AS1 široko izražen in znatno povečan v zdravih celicah v različnih tumorjih, vključno z adenokarcinomom kolona (COAD), ledvičnim svetloceličnim karcinomom (KIRC) in ledvičnim papilarnoceličnim karcinomom (KIRP)..Zelo malo (slika 1d in dopolnilna slika 1a, b). Analiza seznanjenih vzorcev zdravih/tumorskih vzorcev je nadalje potrdila znatno večjo ekspresijo DARS-AS1 v tumorjih urotelijskega karcinoma mehurja (BLCA), ledvičnega svetloceličnega karcinoma (KIRC), adenokarcinoma prostate (PRAD), ploščatoceličnega karcinoma pljuč (LUSC) , karcinom endometrija materničnega telesa (UCEC), pljučni adenokarcinom (LUAD), jetrni hepatocelularni karcinom (LIHC), ledvični papilarnocelični karcinom (KIRP) in adenokarcinom kolona (COAD) (vrednost p < 0,05) (slika 1e–m) . Analiza seznanjenih vzorcev zdravih/tumorskih vzorcev je nadalje potrdila znatno večjo ekspresijo DARS-AS1 v tumorjih urotelijskega karcinoma mehurja (BLCA), ledvičnega svetloceličnega karcinoma (KIRC), adenokarcinoma prostate (PRAD), ploščatoceličnega karcinoma pljuč (LUSC) , karcinom endometrija materničnega telesa (UCEC), pljučni adenokarcinom (LUAD), jetrni hepatocelularni karcinom (LIHC), ledvični papilarnocelični karcinom (KIRP) in adenokarcinom kolona (COAD) (vrednost p < 0,05) (slika 1e–m) .Analiza seznanjenih zdravih/tumorskih vzorcev je potrdila tudi znatno večjo ekspresijo DARS-AS1 pri urotelijskem karcinomu mehurja (BLCA), svetloceličnem ledvičnem in ledvičnoceličnem karcinomu (KIRC), adenokarcinomu prostate (PRAD), ploščatoceličnem karcinomu pljuč (LUSC)., endometrijskega karcinoma telesa maternice (UCEC), adenokarcinoma lakta (LUAD), hepatocelularnega karcinoma pečenja (LIHC), papilarno-celičnega karcinoma očesa (KIRP) in adenokarcinoma tolste sluznice (COAD) (značenje p <0,05) (ris. 1e– m) . , endometrijskega karcinoma materničnega telesa (UCEC), adenokarcinoma pljuč (LUAD), hepatocelularnega karcinoma jeter (LIHC), papilarnoceličnega karcinoma ledvic (KIRP) in adenokarcinoma debelega črevesa (COAD) (vrednost p < 0,05) (slika 1e– m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 DARS-AS1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 (BLCA) 、 肾 肾 透明 细胞癌 细胞癌 (kirc) 、 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 肺鳞状 细胞癌 (lusc) 肿瘤 中 的显着 更 高 表达 ， 子宫体子宫 内膜 癌 （（UCEC） ， （（（（））） 肝肝 细胞癌 （（（）））） 肾 肾 肾 乳头状 细胞癌 （（（Kirp） 和结肠腺癌 （Coad） （P 值<0,05）（图1e-m） .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 了 DARS-OS1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌(LUSC) 肿瘤 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 高 表达 表达 ， 内膜 癌 （（（（（（）） 肺腺癌 （（（））） 肝肝 细胞癌 （（（肾 肾 乳头状 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 乳头状 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0,05）（图1e-m） .Analiza parnih vzorcev zdravega/tumorja je dodatno podprla vlogo DARS-AS1 pri tumorjih urotelijskega karcinoma mehurja (BLCA), svetloceličnega ledvičnoceličnega karcinoma (KIRC), adenokarcinoma prostate (PRAD) in ploščatoceličnega karcinoma pljuč (LUSC).ekspresija pri karcinomu telesa maternice (UCEC), adenokarcinomu lažjega (LUAD), hepatocelularnem karcinomu (LIHC), očesno-počečnem papilarno-celičnem karcinomu (KIRP) in adenokarcinomu tolste črevesja (COAD) (značenje p <0,05) (ris. 1e). -m). izražanje pri karcinomu materničnega telesa (UCEC), pljučnem adenokarcinomu (LUAD), hepatocelularnem karcinomu (LIHC), ledvičnem papilarnoceličnem karcinomu (KIRP) in adenokarcinomu kolona (COAD) (vrednost p <0,05) (slika 1e -m).Ti rezultati skupaj kažejo, da je DARS-AS1 široko in močno izražen v različnih oblikah raka.
Ker imata DARS-AS1 in DARS (gen, ki kodira protismiselno verigo) isti promotor in se nahajata drug zraven drugega, smo zasnovali shRNA tako, da specifično uniči DARS-AS1, ne pa tudi DARS (dodatna slika 2a, b in dodatna tabela 2) .Poleg SW620 smo uporabili tudi tri druge celične linije z visoko ekspresijo DARS-AS1 za preučevanje učinkovitosti in delovanja knockdowna shRNA (dodatna tabela 3).Naši rezultati so pokazali, da so vse tri razvite shRNA dosegle vsaj 80-odstotno učinkovitost uničenja DARS-AS1 z majhnim vplivom na količino mRNA DARS (dodatna slika 2c–f).Poleg tega smo ugotovili, da je DARS-AS1 knockdown s temi shRNA znatno zaviral rast celic v celičnih linijah kolorektalnega raka SW620 (49,7 %) in HCT116 (27,7 %), celični liniji raka dojke MBA-MD-231 (53,4 %).) in celično linijo hepatoma HepG2 (92,7-odstotno zmanjšanje), kot tudi njihovo sposobnost tvorbe nezasidranih kroglic (povprečno zmanjšanje ~50,8%, 44,6%, 40,7% in 75,7% na celično linijo) (sl. 2a,b).V SW620 so rezultati testa tvorbe kolonij dodatno potrdili, da je DARS-AS1 shRNA znatno zavirala celično proliferacijo s povprečnim zmanjšanjem za približno 69,6 % (slika 2c).
Vpliv kontrolne shRNA in DARS-AS1 shRNA na celično proliferacijo (a) in tvorbo sferoidov (b) v celicah SW620, HCT116, MBA-MD-231 in HepG2.c Učinek kontrolne shRNA in DARS-AS1 shRNA na tvorbo kolonij v celicah SW620.Proliferacija celic (d), tvorba sferoidov (e) in tvorba kolonij (f) celic SW620, ki prekomerno izražajo DARS-AS1.Prikazani podatki so povprečje ± standardni odklon treh poskusov.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 in *** p ≤ 0,001 z dvostranskim Studentovim t-testom.
Da bi dopolnili študije izgube funkcije, smo nato ustvarili celice SW620, ki prekomerno izražajo DARS-AS1 (dopolnilna slika 2g).Prekomerna ekspresija DARS-AS1 je bistveno povečala rast celic (1,8-krat), tvorbo nezasidranih sferoidov (1,4-krat) in tvorbo kolonij (3,3-krat) v celicah SW620 (sl. 2d–f).Ta rezultat smo potrdili z uporabo druge celične linije, ki izraža DARS-AS1, A549.To povečano celično proliferacijo zaradi čezmerne ekspresije DARS-AS1 so nadalje opazili v celicah A549 (dodatna slika 2h, i in dodatna tabela 3).Te študije povečanja in izgube skupaj kažejo, da DARS-AS1 spodbuja proliferacijo rakavih celic in vitro.
Da bi raziskali osnovni mehanizem, s katerim DARS-AS1 uravnava celično proliferacijo, smo izvedli padajočo analizo RNA, da bi identificirali njegove potencialne partnerje za vezavo beljakovin.Rezultati RT-qPCR so pokazali, da se približno 86,2 % DARS-AS1 nahaja v citoplazmi celic SW620 (dopolnilna slika 3a).In vitro transkribirano biotinilirano DARS-AS1 ali psevdoRNA smo nato inkubirali s celičnimi lizati SW620, čemur je sledilo ločevanje s SDS-PAGE.Naknadno barvanje s srebrom je pokazalo, da je bil izrazit pas (~38 kDa) znatno obogaten v vzorcih DARS-AS1, vendar ne v vzorcih navideznih RNA ali kroglic (slika 3a).Ta pas je bil identificiran kot protein, ki aktivira PKR (PACT) z masno spektrometrijo (MS) in nadalje potrjen z imunoblotingom v celičnih linijah SW620, HCT116 in HepG2 (sl. 3a,b).Obogatitev DARS in sorodnih proteinov PACT – PKR in TRBP – je bila raziskana tudi z analizo RNA z Western blotting (WB).Rezultati so pokazali, da ni bilo ugotovljene neposredne interakcije med DARS-AS1 RNA in temi tremi proteini (dopolnilna slika 3b).Specifično interakcijo med DARS-AS1 in PACT je dodatno potrdila analiza imunoprecipitacije RNA (RIP), ki je pokazala, da je bil DARS-AS1 znatno obogaten s protitelesi proti PACT, ne pa tudi z drugimi kontrolnimi RNA (slika 3c).Da bi ugotovili, ali DARS-AS1 neposredno sodeluje s PACT v odsotnosti kakršnih koli drugih celičnih komponent, je bil izveden in vitro test interferometrije bioplasti (BLI) z uporabo prečiščenega PACT.Z biotinom označena DARS-AS1 ali navidezna RNA je bila imobilizirana na biosenzorjih streptavidina (SA) in nato inkubirana v kinetičnem pufru, ki vsebuje 1 μM PACT.Predvsem se je PACT močno vezal na DARS-AS1 (vrednost KD ~ 26,9 nM), vendar ne na posnemanje RNA (slika 3d).Ti rezultati skupaj kažejo neposredno interakcijo in visoko afiniteto med DARS-AS1 in PACT.
Analiza vlečenja RNA je identificirala interakcijo DARS-AS1 s PACT v celicah SW620.Zgoraj, srebrno obarvanje sorodnih proteinov.Spodnji imunobloti so bili izvedeni s protitelesom proti PACT.b Analiza padajoče RNA je bila izvedena v celicah HCT116 (zgoraj) in HepG2 (spodaj).Obogatitev PACT je bila odkrita z imunoblotingom.Teste cRNA imunoprecipitacije (RIP) smo izvedli v celicah SW620 z uporabo navedenih protiteles.d Krivulje vezave PACT na DARS-AS1 v polni dolžini ali kontrolno RNA so bile pridobljene z interferometrijo bioplasti (BLI).RNA je bila imobilizirana na streptavidinskem biosenzorju.Za merjenje povezave je bil uporabljen 1 μM PACT.Test vlečenja RNA je bil izveden z uporabo biotiniliranega DARS-AS1 polne dolžine ali okrnjenega (zgoraj).Imunoblot, ki prikazuje prejeti PACT (spodaj).f Očiščen PACT z zastavico je bil inkubiran z biotiniliranim DARS-AS1 polne dolžine ali okrnjen (kot v e) za in vitro test RIP.Ekstrahirano RNA smo preverili z RT-qPCR.g Relativna afiniteta različnih fragmentov RNA za PACT je bila pridobljena z interferometrijo bioplasti.Za analizo smo uporabili 100 nM RNA in 1 μM RAST.h Preskusi RIP in vitro so bili izvedeni z uporabo prečiščenega nepoškodovanega ali okrnjeno označenega PACT.Ekstrahirano RNA smo preverili z RT-qPCR.i Hitrost rasti celic SW620, ki prekomerno izražajo DARS-AS1, PACT ali oboje.j Prekomerna ekspresija polne dolžine ali okrnjenega DARS-AS1 v celicah SW620 je imela različne učinke na rast celic.k Apoptozo smo odkrili z imunoblotingom s protitelesom proti PARP.l Izločitev DARS-AS1 inducira apoptozo celic SW620, kot je pokazala pretočna citometrija.Prikazani podatki so povprečje ± standardni odklon treh poskusov. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, z dvostranskim Studentovim t testom. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, z dvostranskim Studentovim t testom. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 po dvostranskem kriteriju Stjudenta. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 z dvostranskim Studentovim t-testom. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 po dvostranskem kriteriju Stjudenta. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 z dvostranskim Studentovim t-testom.
Nato smo ustvarili tri biotinilirane fragmente DARS-AS1 RNA s transkripcijo in vitro, da smo identificirali regijo DARS-AS1, potrebno za povezavo PACT (slika 3e).Rezultati analize RNA so pokazali, da je bil vsak fragment sposoben interakcije s PACT, vendar je 3'-terminalna regija (384–768 nukleotidov, označenih z A3) pokazala več kot 1–384 nukleotidov, označenih z A1) (slika 3e).Podobne rezultate so opazili pri in vitro testu RIP z uporabo rekombinantnega PACT (slika 3f).V skladu s temi rezultati so poskusi za vezavo imobiliziranih fragmentov RNA na PACT z uporabo BLI tudi pokazali, da ima PACT večjo afiniteto za A3 (384–768 nt) (vrednost KD približno 94,6 nM), medtem ko skoraj ni povezav z drugimi področji.(slika 3d).
Pregledali smo tudi povezane vezne regije v PACT.PACT vsebuje tri funkcionalne domene, od katerih sta dve ohranjeni dvoverižni vezavni domeni RNA (dsRBD) in tretja domena (označena z D3), ki deluje kot aktivator beljakovinskih interakcij.Da bi preučili sposobnost vezave lncRNA vsake domene, smo oblikovali tri mutacije, ki so odstranile vsako od treh domen, in izvedli in vitro RIP test.Naši rezultati so pokazali, da je izbris tretje domene (D3) PACT znatno zmanjšal njegovo interakcijo z DARS-AS1 (za 0,11-krat v primerjavi z nedotaknjenim PACT) v primerjavi z drugima dvema mutacijama (slika 3h), pokazalo se je, da sproščanje D3 sodeloval z DARS.-AC1.Ti rezultati skupaj kažejo, da se lahko interakcija med DARS-AS1 in PACT pojavi predvsem prek 3' konca DARS-AS1 in domene D3 PACT.
Opazili smo, da DARS-AS1 ni vplival na izražanje PACT in PACT ni vplival na DARS-AS1 (dopolnilna slika 3c).Nato smo preučili učinek padca PACT na rast celic.V nasprotju z DARS-AS1 so relativne celice rasle 1, 5–3-krat hitreje, ko je bil PACT podrt (dopolnilna slika 3d).Rezultati testa tvorbe kolonij so pokazali, da so celice oblikovale 2-3-kratne kolonije po obdelavi shRNA s PACT (dopolnilna slika 3e).Da bi preizkusili, ali DARS-AS1 uravnava celično proliferacijo prek PACT, smo ustvarili celice SW620, ki prekomerno izražajo PACT, DARS-AS1 ali oboje.Prekomerna ekspresija PACT je pokazala znatno inhibicijo celične proliferacije (slika 3i).Medtem ko je čezmerna ekspresija DARS-AS1 sama po sebi znatno spodbujala celično proliferacijo, ni bilo pomembne razlike v stopnji rasti celic, ki so prekomerno izražale DARS-AS1 in PACT.Ti rezultati kažejo, da lahko PACT prepreči povečano širjenje, ki ga povzroča čezmerna ekspresija DARS-AS1.
Ker imajo različne regije DARS-AS1 različne sposobnosti vezave PACT, smo raziskali njihov relativni vpliv na celično proliferacijo z različno prekomerno ekspresijo fragmentov DARS-AS1.V primerjavi z drugima dvema fragmentoma je bil DARS-AS1 prekomerno izražen na 3' koncu (384–768 nt), glavni regiji, povezani s PACT, v DARS-AS1, ki je imela največjo sposobnost stimulacije celične proliferacije (slika 3j).Ti rezultati kažejo na pozitivno korelacijo med sposobnostjo vezave in biološko funkcijo DARS-AS1.
Poročali so, da je PACT proapoptotični protein19.Zato smo raziskali učinek DARS-AS1 na apoptozo.Kot je bilo pričakovano, je knockdown DARS-AS1 znatno povečal cepitev PARP v celicah SW620 in povečal delež celic, pozitivnih na aneksin V, v celičnih linijah SW620, HCT116, HepG2 in MBA-MD-231 (slika 3k).3).3f–h), kar kaže, da je anti-apoptotični učinek DARS-AS1 v rakavih celicah nasproten funkciji PACT, ki inducira apoptozo.Ti rezultati skupaj kažejo, da je mehanizem onkogene funkcije DARS-AS1 lahko prek zaviranja funkcije PACT.
Nato smo raziskali funkcionalne posledice povezave DARS-AS1-PACT.Poročali so, da PACT aktivira PKR z neposredno interakcijo, ki nato poveča fosforilacijo eIF2α, kar povzroči translacijsko delecijo in apoptozo17.Najprej smo preverili, ali DARS-AS1 vpliva na celično lokalizacijo PACT in PKR.Konfokalna fluorescenčna mikroskopija je pokazala, da sta bila PACT in PKR močno kolokalizirana v celicah SW620 s povprečnim Pearsonovim korelacijskim koeficientom 0,72.Medtem je čezmerna ekspresija DARS-AS1 znatno zmanjšala solokalizacijo PACT in PKR (povprečni Pearsonov korelacijski koeficient 0,61) (slika 4a).Da bi raziskali, ali lahko DARS-AS1 modulira interakcijo PACT-PKR, smo izvedli test soimunoprecipitacije (co-IP) s protitelesom proti PACT v lizatih celic SW620.PKR je bil močno obogaten z anti-PACT v kontrolnih celicah, medtem ko je bilo obnavljanje PKR znatno zmanjšano v lizatih iz celic, ki so prekomerno izražale DARS-AS1 (slika 4b).Očiščena označena PACT in PKR sta bila uporabljena za in vitro teste vezave na beljakovine.V skladu s tem so tisti, ki so zagotovili DARS-AS1, vendar brez kontrolne RNA, pokazali potlačeno interakcijo PACT-PKR (slika 4c).Vsi rezultati so pokazali, da je DARS-AS1 motil komunikacijo PACT in PKR.
a Ko-lokalizacijo PACT in PKR v kontrolnih celicah ali celicah s čezmerno izraženim DARS-AS1 so opazili s konfokalno fluorescenčno mikroskopijo.Jedra so bila obarvana z DAPI.Statistični rezultati so bili pridobljeni iz 16 fotografij.b Ko-imunoprecipitacija (co-IP) z uporabo protiteles proti PACT v celičnih lizatih kontrolnih celic SW620 ali celic s čezmerno izraženim DARS-AS1.c Označen PACT, prečiščen PKR in prepisan in vitro z DARS-AS1 ali lažno RNA smo inkubirali za in vitro analizo vezave na beljakovine.Za imunoprecipitacijo so uporabili protitelesa proti zastavici.d Imunobloti z navedenimi protitelesi so bili izvedeni v celicah SW620 in HCT116, transficiranih s kontrolno shRNA ali DARS-AS1-shRNA, čemur je sledilo serumsko stradanje.Raven izražanja DARS-AS1 je spremenila celično občutljivost na tapsigargin.Celice SW620 so bile transfektirane z DARS-AS1 shRNA, prekomerno ekspresijskim plazmidom DARS-AS1 ali kontrolnim plazmidom.Celice smo 48 ur obdelali s tapsigarginom in z reagentom MTS določili viabilnost celic.f In vitro prepisani DARS-AS1 ali navidezna RNA in prečiščen PACT sta bila uporabljena za in vitro aktivacijski test in detekcijo imunoblota.g Imunobloti z uporabo teh protiteles so bili izvedeni na celicah SW620-ctrl (levo) ali celicah, ki prekomerno izražajo mutante PKR (desno).Te celice so bile nato transficirane s kontrolno shRNA ali DARS-AS1-shRNA, čemur je sledilo serumsko stradanje.h Pretočna citometrija je pokazala, da je inaktivacija mutantnega PKR kompenzirala apoptozo, ki jo povzroča DARS-AS1, v celicah SW620.i Imunobloti z navedenimi protitelesi so bili izvedeni v celicah SW620 (levo) ali HCT116 (desno).Celicam, transfektiranim s kontrolno shRNA ali DARS-AS1 shRNA, odvzamemo serum in jim dodamo 100 nM inhibitorja PKR C16 ali DMSO.Lestvica = 5 µm.Prikazani podatki so povprečje ± standardni odklon treh poskusov.* p ≤ 0,05 dvostranski Studentov t-test.
Na splošno se verjame, da ko PACT medsebojno deluje s PKR17, se lahko inducira fosforilacija PKR pri Thr451.Naši rezultati so pokazali, da je bila raven fosforilacije PKR znatno povišana v knockdown celicah DARS-AS1 po serumskem stradanju (slika 4d in dopolnilna slika 4a).V skladu s tem smo ugotovili, da je bila fosforilacija eIF2α, glavnega substrata PKR, tudi znatno povečana z DARS-AS1 shRNA (slika 4d in dopolnilna slika 4a).Tapsigargin je ER stresor, ki povzroči, da ER sprošča Ca2+.Poročali so, da zdravljenje s tapsigarginom inducira ekspresijo in aktivacijo PACT, ki nadalje vpliva na in aktivira PKR, kar vodi do apoptoze s povečanjem fosforilacije eIF2α 18,61.Tu smo uporabili tapsigargin kot stimulator poti PACT/PKR, da bi raziskali, ali lahko DARS-AS1 pomaga celicam pri premagovanju stresa z zaviranjem poti PACT/PKR.Opazili smo, da je raven izražanja DARS-AS1 pozitivno povezana s celično odpornostjo na tapsigargin.Celice SW620 s prekomerno ekspresijo DARS-AS1 so bolje preživele pri zdravljenju s tapsigarginom, medtem ko so celice z uničenjem DARS-AS1 postale bolj dovzetne (slika 4e).V skladu s temi rezultati je prekomerna ekspresija DARS-AS1 zmanjšala fosforilacijo PKR, ki jo povzroča tapsigargin (dopolnilna slika 4b).Nasprotno pa sta bila po zdravljenju s tapsigarginom PKR in eIF2α v večji meri fosforilirana v knockdown celicah DARS-AS1 v primerjavi s kontrolnimi celicami (dodatna slika 4b).Zanimivo je, da je tapsigargin povzročil ekspresijo DARS-AS1 na način, ki je odvisen od odmerka, kar lahko kaže na protistresno funkcijo DARS-AS1 (dopolnilna slika 4c).Poleg tega smo izvedli in vitro aktivacijske teste, da bi potrdili ta opažanja.Na kratko, PKR smo očistili iz celičnih lizatov z uporabo protitelesa proti PKR, nato inkubirali z rekombinantnim PACT in DARS-AS1, prepisanim in vitro.Po encimski reakciji smo s pomočjo WB odkrili fosfo-PKR.Naši rezultati so pokazali, da je fosforilacijo PKR znatno zaviral DARS-AS1, ne pa tudi kontrolna RNA (slika 4f).Ti rezultati in vitro in in vivo kažejo, da DARS-AS1 zavira aktivacijo PKR, ki jo posreduje PACT.Hkrati smo opazili tudi zmanjšanje izkoristka PACT v prisotnosti DARS-AS1 (slika 4f).Ta rezultat je skladen z rezultati testa vezave na beljakovine in vitro (slika 4c) in ponovno ponazarja funkcijo blokiranja DARS-AS1 za povezavo PACT-PKR.
Ser246 in Ser287 v domeni D3 PACT sta potrebna za aktivacijo PKR pod celičnim stresom.Zamenjava dveh serinskih ostankov za alanin je dala mutant PACT (mutD), ki je aktiviral PKR v odsotnosti stresa, zamenjava za alanin (mutA) pa je obrnila protokol.Ker smo dokazali pomembnost te domene v neposredni povezavi z DARS-AS1, smo ustvarili ta dva mutanta PACT, da bi preizkusili, ali bi ti ostanki lahko bili vključeni tudi v interakcijo z DARS-AS1.Zanimivo je, da sta oba mutanta izgubila sposobnost vezave na DARS-AS1 (dodatna slika 4d), kar kaže, da je za učinkovito interakcijo z DARS-AS1 morda potrebna celotna struktura proteina PACT.
Poleg tega naši rezultati tudi kažejo, da je mogoče inhibicijo celične proliferacije, ki jo povzroči DARS-AS1-shRNA, delno obnoviti s prekomerno ekspresijo dominantnega negativnega mutanta PACT (PACTmutA) ali dominantnega negativnega mutanta PKR (PKRmut) (dopolnilna slika 4e. e).Prekomerna ekspresija dominantno negativnih mutantov PKR je zmanjšala fosforilacijo PKR, inducirano z knockdownom DARS-AS1, kot tudi fosforilacijo eIF2α v celicah brez seruma (slika 4g).Še pomembneje je, da je bil delež apoptotičnih celic, induciranih z uničenjem DARS-AS1, zmanjšan tudi v celicah, ki prekomerno izražajo PKRmut (slika 4h in dopolnilna slika 4g).Inhibicija aktivnosti PKR kinaze tudi poslabša funkcijo DARS-AS1, saj so rezultati pokazali, da je knockdown DARS-AS1 redko sprožil fosforilacijo PKR in eIF2α, ko so bile celice obdelane s PKR-specifičnim zaviralcem C16 (slika 4i in dopolnilna slika 4h).).Naši rezultati skupaj kažejo, da DARS-AS1 spodbuja celično proliferacijo, vsaj delno, z zaviranjem aktivacije PKR, ki jo posreduje PACT.
Za nadaljnje raziskovanje vloge DARS-AS1 pri tumorigenezi smo izvedli poskuse in vivo z uporabo modela mišjega ksenografta. Rezultati kažejo, da je knockdown DARS-AS1 dramatično zmanjšal rast tumorja pri miših (vrednost p < 0,0001) (slika 5a). Rezultati kažejo, da je knockdown DARS-AS1 dramatično zmanjšal rast tumorja pri miših (vrednost p < 0,0001) (slika 5a). Rezultati kažejo, da nokdaun DARS-AS1 rezko zmanjša rast opuholi v miših (pomen p <0,0001) (ris. 5а). Rezultati kažejo, da knockdown DARS-AS1 drastično zmanjša rast tumorja pri miših (vrednost p < 0,0001) (slika 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）（图5a）。 Rezultati so pokazali, da nokdaun DARS-AS1 znatno zmanjša rast opuholi v miših (pomen r <0,0001) (ris. 5а). Rezultati so pokazali, da je knockdown DARS-AS1 znatno zmanjšal rast tumorja pri miših (vrednost p < 0,0001) (slika 5a).Tako je v knockdown skupini DARS-AS1 prišlo do pomembnega zmanjšanja povprečnega volumna tumorja za približno 72,9 % in povprečne tumorske mase za približno 87,8 % (slika 5b-d).Ti rezultati močno kažejo, da lahko DARS-AS1 znatno spodbuja rast tumorja in vivo.
Učinki knockdowna ad DARS-AS1 na kolorektalno onkogenezo pri golih miših.Prikazane so krivulje rasti (a), velikost tumorja (b), teža (c) in slike tumorja (d).Vrstice napak predstavljajo ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, z dvostranskim Studentovim t testom. n = 10. ****p < 0,0001, z dvostranskim Studentovim t testom. n = 10. ****p < 0,0001 po dvostranskem kriteriju Stjudenta. n = 10. ****p < 0,0001 dvostranski Studentov t-test.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 po dvostranskem kriteriju Stjudenta. ****p < 0,0001 dvostranski Studentov t-test.Kaplan-Meier je analiziral korelacijo med stopnjami izražanja DARS-AS1 in celokupnim preživetjem pri bolnikih z UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM in LGG.Visoke ravni izražanja DARS-AS1 pri bolnikih so bile v zgornjih 50 %;nizka stopnja izražanja DARS-AS1 pri bolnikih je bila v spodnjih 50 %.p-vrednosti so bile določene z uporabo log rank testa.f Predlagani model, v katerem DARS-AS1 uravnava pot PACT-PKR in rast tumorja.
Da bi bolje razumeli klinični vpliv DARS-AS1, smo preučili korelacijo med njegovim izražanjem in preživetjem bolnikov.Z analizo nabora podatkov TCGA smo ugotovili, da je višja ekspresija DARS-AS1 povezana z uvealnim melanomom (UVM), ledvično kromofobijo (KICH), ledvičnim papilarnoceličnim karcinomom (KIRP), mezoteliomom (MESO), multipleksom.Nižje preživetje je bilo pomembno povezano z morfozo glioblastoma (GBM) in bolniki z možganskim gliomom nizke stopnje (LGG) (slika 5e).Ti rezultati kažejo, da ima lahko DARS-AS1 pomembno vlogo pri kliničnem napredovanju tumorja in je lahko potencialni napovedni biomarker pri več vrstah raka.
V tej študiji smo z uporabo obsežnega funkcionalnega presejanja CRISPRi ugotovili, da DARS-AS1 lncRNA premaga stres rakavih celic z uravnavanjem dveh ključnih odzivnikov na stres, PACT in PKR.Z neposredno interakcijo s PACT je DARS-AS1 zaviral aktivacijo PKR, posredovano s PACT, s čimer je preprečil apoptotično celično smrt in spodbudil celično proliferacijo (slika 5f).Uravnavanje DARS-AS1 je bilo opaženo pri več vrstah raka, kar kaže na to, da je njegova funkcija spodbujanja preživetja rakavih celic v stresnih razmerah lahko široko uporabna za več vrst raka.
PACT je bil identificiran kot protein aktivatorja PKR in aktivacija PKR, posredovana s PACT, igra pomembno vlogo pri odzivih na stres z uravnavanjem transkripcije, prevajanja, apoptoze in drugih pomembnih celičnih procesov62.Že desetletja se poskuša razumeti za raka specifično regulacijo kaskade PACT-PKR.Tu je naša študija razkrila drugačen mehanizem regulacije PACT-PKR v rakavih celicah prek celične lncRNA DARS-AS1, ki se neposredno veže na PACT, blokira interakcijo PACT-PKR, zavira aktivacijo PKR in fosforilacijo eIF2α, s čimer zavira stresno povzročeno apoptozo in spodbujanje morebitne proliferacije raka.celice.To odkritje osvetljuje potencialne tarče lncRNA za prognozo in zdravljenje raka.
Naši podatki so pokazali, da knockdown DARS-AS1 senzibilizira celice na serumsko stradanje s pomembnim povečanjem fosforiliranega PKR in eIF2α.Ti rezultati kažejo, da DARS-AS1 spodbuja preživetje rakavih celic v težkih pogojih z zaviranjem aktivnosti PACT/PKR.Več drugih nekodirajočih RNA, kot sta ASPACT in nc886, je prav tako vključenih v os PACT/PKR z znižanjem regulacije mRNA PACT48 ali regulacijo avtofosforilacije z vezavo na PKR49, 50, 64.Med njimi DARS-AS1 deluje kot motilec zveze PACT-PKR.Ta študija bogati naše razumevanje regulacije osi PACT/PKR in vloge lncRNA pri odzivih na stres.
PACT vsebuje tri ločene domene.Vsak od prvih dveh dsRBD zadostuje za doseganje visoke afinitete vezave PACT na PKR, medtem ko je tretja domena (D3) potrebna za aktivacijo PKR in vitro in in vivo.Naša študija je pokazala, da DARS-AS1 prednostno sodeluje z domeno D3 (slika 3h).Glede na veliko velikost lncRNA (768 nukleotidov) lahko vezava DARS-AS1 na D3 fizično zavre interakcijo med domeno PACT dsRBD in PKR ter tako blokira povezavo PACT in PKR.Točkovne mutacije PACT, ki so nadomestile Ser246 in Ser287 v D3 z alaninom ali aspartatom, so motile njegovo vezavno afiniteto za DARS-AS1, kar kaže na pomembnost splošnih strukturnih in električnih lastnosti D3 v njuni povezavi.Nadaljnje podrobnosti o tem mehanizmu bodo potrebne v prihodnosti z uporabo natančnejše biokemijske analize in strukturne analize PACT visoke ločljivosti.
Prejšnje študije so poročale, da DARS-AS1 spodbuja celično proliferacijo prek več mehanizmov 51, 52, 53.V enem primeru so raziskovalci opazili, da je DARS-AS1 navzgor uravnal svoj gen DARS, ki kodira protismiselne beljakovine, tako da je ciljal na miP-194-5p v rakavih celicah ledvic.Vendar pa je v tej študiji knockdown DARS-AS1 le malo vplival na transkripcijo DARS pri več vrstah raka, vključno vsaj z rakom debelega črevesa in danke, dojke in jeter.Ker lncRNA kažejo vzorce izražanja, specifične za celice in tkiva, se funkcionalni mehanizmi morda ne bodo ohranili med vrstami raka, kar lahko prispeva k temu neskladju med našimi opazovanji in prejšnjimi ocenami različnih vrst raka.Za pojasnitev specifičnih mehanizmov različnih fizioloških in patoloških procesov so potrebne posebne študije.
Analiza kliničnih podatkov je pokazala, da je izražanje DARS-AS1 v tumorjih v obratni korelaciji s preživetjem bolnikov z rakom, kar poudarja pomen osi DARS-AS1/PACT/PKR pri prognozi raka.Na koncu naša študija kaže, da je DARS-AS1 regulator signalne osi PACT/PKR, spodbuja proliferacijo rakavih celic in zavira apoptozo med odzivom na stres, kar zagotavlja drugo smer raziskav in je zanimivo za prihodnje raziskave možnih zdravljenj .
Človeške celične linije SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 in HEK293T so bile pridobljene iz Nacionalne infrastrukture celičnih linij na Kitajskem.Vse celice so bile vzdrževane v mediju DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), dopolnjenem z 10 % FBS (Gemini, Brooklyn, NY) in 1 % penicilin-streptomicina (Thermo Fisher Scientific) pri 37 °C, 5 % CO2.inkubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fosfor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);normalni mišji IgG, CST (5415S);normalni kunčji IgG, CST (2729S).Protitelesa so bila razredčena 1:1000 v PBST za Western blotting in 1:100 za IP.
sgRNA so bile razvite z uporabo javno dostopnega orodja, imenovanega CRISPR-ERA66.Uporabili smo privzete parametre orodja za razvoj sgRNA, algoritem pa je izračunal vezavna mesta sgRNA v regiji 3 kb.s središčem v TSS.Skupine oligonukleotidov sgRNA so sintetizirali pri CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) in klonirali v humanizirane plazmide pgRNA (Addgene #44248).Skupno 12 µg združenega humaniziranega plazmida pgRNA, 7,2 µg psPAX2 (Addgene #12260) in 4,8 µg pMD2.G (Addgene #12259) smo sotransfektirali v 5 x 106 HEK293T v 10 cm posodah z uporabo DNAfect Transfection Reagent celic (CWBIO, Peking, Kitajska) po navodilih proizvajalca.Supernatante, ki vsebujejo virus, smo zbrali 48 in 72 ur po transfekciji in filtrirali skozi 0,45 µm filter.Za presejanje so bile celice SW620, ki izražajo fuzijski protein dCas9/KRAB, pridobljene s transdukcijo virusa.Modificirane celice SW620 so bile okužene z virusno knjižnico v štirih neodvisnih poskusih okužbe pri MOI 0,1-0,3 in vzorčene z 2 μg/ml puromicina (Sigma, St. Louis, MO) 2 dni.Nato so celice gojili 18 dni in vitro z najmanjšo pokritostjo knjižnice 500 celic/sgRNA za presejanje.
Genomsko DNK smo ekstrahirali v skladu z navodili QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Nemčija; 51183).Skupno je bilo za izdelavo knjižnice uporabljenih 100 μg genomske DNA na biološko ponovitev.Področje sgRNA je bilo pomnoženo z dvema krogoma PCR in povezano s črtno kodo.
Produkte PCR smo očistili z uporabo gela NucleoSpin® in kompleta za čiščenje PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Nemčija; 740609.250) in kvantificirali z uporabo kompleta za odkrivanje dvoverižne DNA Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
MTS test je bil uporabljen za merjenje celične proliferacije.Celice smo zasejali v plošče s 96 vdolbinicami pri začetni gostoti 2000 celic/vdolbinico.Relativno število celic smo merili vsak dan ob navedenem času skupno 4-6 dni.Za vsako jamico smo 20 μl MTS reagenta (Promega) razredčili s 100 μl DMEM, inkubirali s celicami 4 ure pri 37 °C in nato izmerili OD490.
Sposobnost nezasidrane rasti je bila odkrita z analizo nastajanja kroglic.Na kratko, 2000 celic, transficiranih s shRNA DARS-AS1 ali kontrolno shRNA, smo gojili v mikroploščah z ultra nizko pritrditvijo (Corning) s spremembo medija vsake 4 dni.Sferoidi so bili prešteti po 14 dneh.Za test povečanja smo uporabili 500 celic, transficiranih s prekomerno ekspresijskim plazmidom DARS-AS1 ali kontrolnim plazmidom, sicer je bila metoda nespremenjena.
RNA je bila prepisana z uporabo T7 RNA polimeraze in biotin-16-UTP (Roche 1138908910) v skladu z navodili Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Tukaj uporabljeni primerji so navedeni v dodatni tabeli 4.
Regije PACT ali PKR, ki kodirajo beljakovine, so bile klonirane v pET15b (Addgene #73619) in transformirane v BL21(DE3).Bakterije so bile čez noč inkubirane v LB, dobavljenem z ampicilinom, nato pa 100-krat razredčene s svežim LB.Ko je OD600 medija dosegel 0,8, smo dodali 1 mM IPTG, da induciramo ekspresijo proteina.Po inkubaciji preko noči z nežnim stresanjem (250 vrt/min pri 20 °C) smo celično peleto zbrali s centrifugiranjem (4000 vrt/min, 10 min, 4 °C).Ponovno suspendirajte celični pelet v pufru za lizo (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) in inkubirajte na ledu 30 minut, nato sonikirajte (15 minut, 5 s vklop/izklop, na ledu) in centrifugirajte (13.000 vrtljajev na minuto)., 30 min, 4°С).Supernatant smo nato 3-krat naložili na Ni-NTA smolo (QIAGEN) pri 4 °C, 4-krat sprali s pufrom za izpiranje (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazola, 250 mM NaCl) in 3-krat eluirali s skupno 10 ml eluentnega pufra (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazola).Očiščen protein je bil določen z uporabo WB in koncentracija je bila določena z uporabo kompleta za testiranje beljakovin Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
RIP testi so bili izvedeni, kot je opisano prej, s spremembami.Na kratko, 1x RIP pufer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 % NP-40, RNasin ribonukleazni inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, proteaza) lizira citostatik 1 x 107 koktajl (Roche, 1 mM DTT) in centrifugirajte pri 13.000 obratih na minuto 15 minut pri 4 °C.Supernatant smo nato inkubirali z magnetnimi kroglicami proteina A+G (Millipore), konjugiranim s 5 μg protiteles proti PACT (Abeam) ali IgG (CST).Kroglice so bile 5-krat sprane s 5x RIP pufrom, nato razgrajene s proteinazo K (NEB).RNA je bila ekstrahirana s Trizolom in določena z RT-qPCR.Primerji so predstavljeni v dodatni tabeli 5.
Test RIP in vitro je bil izveden v skladu s spremenjenim standardnim protokolom testa RIP.Skupno 5 pmol in vitro prepisane RNA smo razredčili 1x s pufrom RIP in žarili z inkubacijo pri 65 °C 5 minut, čemur je sledilo počasno ohlajanje na sobno temperaturo.Skupaj 5 pmol nedotaknjenih ali mutiranih proteinov PACT, označenih z zastavico, smo očistili iz E. coli.Inkubirajte z renaturirano RNA 2 uri pri 4 °C in sledite zgornjemu postopku za analizo RIP za anti-flag IP.
Za analizo razširitve RNA smo 1 × 107 celic lizirali s pufrom 1xRIP.Po centrifugiranju pri 13.000 obratih na minuto 15 minut pri 4 °C smo supernatant predhodno obdelali s 30 μl magnetnih kroglic streptavidina (Beckman) 2 uri pri 4 °C.Očiščenemu lizatu smo nato dodali tRNA kvasa in ga inkubirali s 40 pmol renaturirane RNA čez noč pri 4 °C, nato še 2 uri in dodali 20 μl novih magnetnih kroglic streptavidina, blokiranih z BSA.Korak pranja je obsegal 4-krat s 5x RIP pufrom in 4-krat z 1x RIP pufrom.Ustrezne proteine ​​smo eluirali z biotinskim elucijskim pufrom (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotin, PMSF) in ločili na NuPAGE 4-12% Bis-Tris gelu (Invitrogen).Po barvanju s srebrom (Beyotime Biotechnology) so bili določeni pasovi izrezani in analizirani z MS.
Analiza Co-IP je bila izvedena za testiranje interakcije med PACT in PKR.Na kratko, supernatantne lizate smo pripravili z inkubacijo 1 x 107 liziranih celic v 1 x RIP pufru, čemur je sledilo centrifugiranje pri 13.000 obratih na minuto 15 minut pri 4 °C.Lizate smo naložili z magnetnimi kroglicami proteina A + G, konjugiranim s 5 µg protitelesa proti PACT in jih nežno vrteli čez noč pri 4 °C.Kroglice so bile 3-krat sprane s 5 × RIP pufrom, dvakrat z 1 × RIP pufrom in eluirane z 1 × SDS pufrom.Rekuperirani protein je bil analiziran z SDS-PAGE gelom in odkrit z WB.
Dva pmola označenega PACT in 1 pmol PKR smo očistili iz E. coli.Razredčite v 1 × pufru RIP in inkubirajte z 10 pmol renaturirane RNA 2 uri pri 4 °C.Po tem so bili dodatni dve uri inkubirani z anti-označenim protitelesom, konjugiranim z magnetnimi kroglicami proteina A+G.Kroglice smo nato štirikrat sprali z 1x RIP pufrom in eluirali z 1x SDS pufrom.WB je zaznala nastala PACT in PKR.